苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠骨代謝生化指標的影響

劉仰斌，張志花

(贛南醫學院　基礎醫學院，江西　贛州　341000)

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·基礎醫學·

苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠骨代謝生化指標的影響

劉仰斌，張志花

(贛南醫學院基礎醫學院，江西贛州341000)

【摘要】目的：探討苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠骨代謝的影響。方法：用去卵巢方法建立豚鼠骨代謝紊亂動物模型，30只雌豚鼠，隨機分為5組：正常對照組、骨質疏松模型組、陽性藥物組、低劑量苦菜總黃酮組(0.1 mg/kg)、高劑量苦菜總黃酮組(0.3 mg/kg)。建模1周后，分別給予生理鹽水、雌激素和不同劑量的苦菜總黃酮，給藥6周后，檢測豚鼠骨長度和骨質量指數，同時檢測血清電解質、堿性磷酸酶(AKP)、骨鈣素(BGP)和肝組織抗酒石酸酸性磷酸酶(TrACP-5b)等生化指標。結果：①苦菜總黃酮可以增大股骨和脛骨長度指數；②苦菜總黃酮可提高降鈣素的含量；③苦菜總黃酮能升高血清AKP，降低TrACP-5b的含量。結論： 苦菜總黃酮可通過調節骨形成和骨吸收途徑，改善去卵巢豚鼠骨代謝的紊亂，顯示類雌激素樣功效，對絕經后骨質疏松癥可能起治療作用。

【關鍵詞】苦菜；總黃酮；去卵巢；豚鼠；骨代謝

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.03.002

隨著年齡的增長，女性卵巢的功能在減退，尤其是絕經后雌激素的下降，導致其各代謝系統出現改變，如血脂增高、動脈硬化、骨質疏松等[1-2]。臨床上多用雌激素來治療女性因雌激素下降而引起的癥狀，但各種合成的雌激素不良反應較大，使其在臨床上的應用受限。苦菜在國內分布很廣，日常生活中人們長期應用。我們在前期的研究中發現苦菜總黃酮具有降血脂、抑菌、抗病毒、抗腫瘤、改善血液系統等作用[3-7]，可以降低去卵巢豚鼠的Lee′s指數并改善其血脂代謝情況[8]。為進一步研究和推廣苦菜的作用，我們通過建立去卵巢豚鼠的骨質疏松模型，觀察苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠骨代謝的生化指標影響，為苦菜總黃酮在臨床上的應用提供實驗依據。

1材料與方法

1.1藥品與試劑苦菜總黃酮按照文獻[3]的方法先配制好，實驗前用雙蒸水稀釋至實驗各組所需濃度。戊酸雌二醇片(拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，批號：030A)，降鈣素(calcitonin，CT)、血清骨鈣素(bone gla protein,BGP)、抗酒石酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TrACP-5b)、血清堿性磷酸酶(alkaline aphosphatase,AKP)測試盒(均為上海酶聯生物科技有限公司)。水合氯醛(天津海晶精細化工廠，批號：20061215)，其他試劑均為市售分析純。

1.2主要儀器設備Gemini XPS熒光酶標儀(美谷分子儀器上海有限公司)；超速低溫離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司)；SN-695型智能放免γ測量儀(上海核輻光電儀器有限公司)；HD-F2600全自動生化分析儀(濟南漢方醫療器械有限公司)。

1.3動物分組豚鼠30只，SPF級,均為雌性，自由飲食，體質量350～400 g，由贛南醫學院實驗動物中心提供，許可證號為SYXK(贛)2007-0002。根據實驗動物使用的3R原則，在實驗前所有豚鼠均給予人道的關懷，實驗前適應性飼養1周。實驗時30只豚鼠隨機分為5組(每組6只)：①正常對照組(假手術組)，②骨質疏松模型組(卵巢切除組)，③陽性藥物對照組[卵巢切除+戊酸雌二醇，80 mg/(kg·d)]，④低劑量組(卵巢切除+苦菜總黃酮，0.1 mg/kg)，⑤高劑量組(卵巢切除+苦菜總黃酮，0.3 mg/kg)。

1.4方法

1.4.1動物模型制備術前豚鼠禁食1 d，不禁水。用10%的水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉后，于平臥位消毒，打開腹腔，行腹側雙側卵巢切除；正常對照組僅探查卵巢，不切除，余操作同模型組。術后1周各組行陰道脫落細胞檢查，以明確卵巢切除成功。陽性藥物組按80 mg/kg戊酸雌二醇混懸液灌胃，苦菜總黃酮組分另按0.1 mg/kg、0.3 mg/kg劑量灌胃，給藥體積為0.5 mL/100g 體質量，對照組及骨質疏松模型組大鼠給予等體積的生理鹽水，每天1次，連續6周。

1.4.2血清生化檢測給藥6周后，麻醉大鼠，腹腔動脈取血，2000 r/min，4 ℃，離心15 min，分離血清，于-80 ℃冰箱保存。全自動生化分析儀檢測血清鈣、鎂和磷的水平；酶分析方法檢測血清AKP和TrACP-5b活性。

1.4.3放射免疫學方法檢測血清BGP和CT的含量：取血清，解凍后，3000 r/min，離心10 min，取上清100 μL于已編寫號碼的放免專用試管中，加入相應的抗血清100 μL，混勻，再分別加入125I標記的BGP、CT，混勻，另設總放射值管、非特異反應管(不加入抗血清)及標準管(S0～S5)，4 ℃孵育24 h。除總放射管值外，每管加入免疫分離劑500 μL，充分混勻，室溫放置20 min后，4 ℃，3000 r/min，離心10 min，棄上清，在SN-695型智能放免γ測量儀上測定cpm(每分鐘多少次衰變)值，半對數繪制標準曲線，分別計算每管血清BGP、CT的含量。

1.4.4骨質量及長度指數檢測分別稱量腰椎、股骨、脛腓骨質量，測量股骨、脛腓骨長度，計算腰椎、股骨、脛腓骨質量指數(骨質量/豚鼠質量)，股骨和脛腓骨長度指數(骨質量/骨質長度)。

2結果

2.1血清Ga2+、Mg2+、磷含量與正常對照組相比，模型組豚鼠血清Ca2+和Mg2+含量降低、磷含量升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性藥物組血Ca2+水平升高,磷下降(P<0.05)，苦菜總黃酮各組血Ca2+含量升高(P<0.05)，磷含量與模型組無明顯差異，見表1。

表1苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠血清電解質含量的影響

分組nGa2+/(mmol/L)Mg2+/(mmol/L)磷/(mmol/L)正常對照組64.83±0.311.78±0.092.54±0.31模型組64.08±0.34*1.70±0.10*2.90±0.22*陽性藥物組64.70±0.68#1.74±0.042.76±0.18#低劑量組65.09±0.39#1.66±0.012.95±0.21高劑量組64.85±0.58#1.75±0.052.85±0.20F3.7122.9332.994P<0.05<0.05<0.05

注：*P<0.05與正常對照組相比，#P<0.05與模型組相比。

2.2血清AKP活性和肝組織TrACP-5b活性與正常對照組相比，模型組豚鼠血清AKP活性降低(P<0.01)，肝組織TrACP-5b活性升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性藥物組肝組織TrACP-5b活性降低(P<0.01)，苦菜總黃酮各組AKP活性升高(P<0.01)，肝組織TrACP-5b活性降低(P<0.05)，見表2。

表2苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠血清AKP及肝臟TrACP-5b活性的影響

分組nAKP/(U/L)TrACP-5b/(U/L)正常對照組612.67±3.613.17±0.42模型組68.17±1.89**3.99±0.31**陽性藥物組68.55±2.902.89±0.30#低劑量組613.10±4.51##3.01±0.31#高劑量組615.10±2.20##3.20±0.34#F5.4819.714P<0.05<0.05

注：*P<0.05,**P<0.01與正常對照組相比，#P<0.05，##P<0.01與模型組相比。

2.3血清BGP和CT含量與正常對照組相比，模型組豚鼠血清CT含量降低(P<0.05)；與模型對照組相比，陽性藥物組血清CT含量升高(P<0.01)，苦菜總黃酮各組CT含量升高(P<0.01)，見表3。

2.4骨密度、骨長度和骨質量指數與正常對照組相比，模型組豚鼠的股骨和脛骨長度指數均減小(P<0.05，P<0.01)；實驗6周后與模型組相比，陽性藥物組、苦菜總黃酮各組股骨、脛骨長度指數均提高(P<0.05，P<0.01)，見表4。

表3苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠BGP、CT的影響

分組nBGP/(ng/mL)CT/(pg/mL)正常對照組68.39±1.63138.02±23.43模型組611.09±2.1989.13±11.06*陽性藥物組68.55±1.51124.61±25.94##低劑量組69.82±1.55111.09±14.97##高劑量組610.32±1.79124.01±19.29##F2.6155.256P>0.05<0.05

注：*P<0.05與正常對照組相比，##P<0.01與模型組相比。

表4苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠骨長度和骨質量指數的影響

分組n腰椎質量指數/(g/kg)股骨質量指數/(g/kg)脛腓骨質量指數/(g/kg)股骨長度指數/(mm/kg)脛骨長度指數/(mm/kg)正常對照組64.99±0.574.15±0.1418.61±0.66135.35±8.59149.31±8.91模型組64.28±0.363.46±0.0618.14±1.05119.87±3.68**133.01±6.45**陽性藥物組64.90±0.744.23±0.2018.50±0.93137.99±5.70##183.76±7.59##低劑量組65.29±0.423.91±0.8618.70±1.01124.53±4.32#139.71±6.78#高劑量組64.98±0.803.99±0.9818.98±1.02127.67±5.94#143.21±7.69#F2.2691.5380.6309.76441.787P>0.05>0.05>0.05<0.01<0.01

注：**P<0.01與對照組相比，#P<0.05，##P<0.01與模型組相比。

3討論

正常情況下，骨形成和骨吸收通過各種調節信號緊密相連。當骨吸收活躍并引起骨密度降低和骨組織微結構破壞時，就會導致骨質疏松癥的發生，隨之而來就是骨脆性增加和骨折風險增加。骨質疏松癥并發脆性骨折可使患者致殘，嚴重危及患者生活質量[9]。盡管骨質疏松癥已經是嚴重威脅老年人健康的疾病，但是如何診斷和評估骨質疏松癥危害性卻一直沒有定論。國內外比較常用的是通過雙能X線進行骨密度檢測[10]，但是最近研究認為它僅僅能檢測受測部位的骨代謝，不能做全身骨質情況評估，更不能很好地預測患者骨折的風險，因此評估骨質疏松的風險往往需要綜合個體情況及骨生化指標來完成[11]。骨轉換指標(bone turnover markers，BTMs)雖然不是診斷骨質疏松的標準，臨床效用有限，但是抗骨質疏松治療后，可以通過骨轉換指標全面評價人體骨的代謝情況，從而間接判斷抗骨質疏松效果并預測骨折的風險，因此得到不少學者的高度重視[12]。

目前用于制作骨質疏松模型的動物很多，其中實驗鼠因操作簡單，成本低，實驗要求差異性最少而成為最常用的模型動物。實驗鼠模型制作方法很多，可行卵巢、睪丸、垂體切除，也可使用激素類藥物達到骨丟失的目的，但最終仍是通過生化檢查、骨形態計量學等方法監測和評價該動物模型在預防或治療骨質疏松癥的效果[13]。本研究中，我們僅通過切除成年雌性豚鼠的卵巢模擬婦女絕經后的狀態，獲得了去卵巢骨質疏松豚鼠模型，實驗過程中各組豚鼠均保持平穩狀態，沒有出現豚鼠異常或死亡現象，顯示本模型穩定性好，可重復操作。

成骨細胞(Osteoblast，OB)和破骨細胞(Osteoclast，OC)是骨代謝最重要的核心細胞，骨代謝的關鍵就是這兩種細胞代謝變化的結果[14-15]。目前反映成骨細胞的標志物較多，如AKP、BGP、Ⅰ型前膠原羧基末端肽(PICP)等，其中AKP和BGP因擁有較好的生物穩定性、較低的個體差異性且檢測方法簡單成為評估成骨細胞活性的重要指標[16]，PICP作為成骨代謝產物也是反映成骨細胞活性的重要指標，但是其結果易受干擾，如半衰期只有6～8 min[17]，且在體內受不同時間變化而變化，研究發現PICP人體含量凌晨比中午高20%，Vasikaran S等研究認為PICP可能不僅僅來源于骨代謝，因此沒有很好的特異性，一定程度上限制了其在實踐中的運用[18]。TrACP是目前臨床上判斷成骨細胞和破骨細胞活性的重要生化標志物，也是骨質疏松癥重要監測指標之一。體外實驗證明，在骨吸收過程中，破骨細胞活躍，同時大量分泌TrACP，因此TrACP 水平可反映破骨細胞活性和骨吸收狀態[19]。絕經期后的女性因內源性雌激素減少，骨重建失衡，骨吸收大于骨形成，會出現TrACP顯著增加。在正常人血清中，TRACP 以兩種基化形式存在：TRACP-5a 和TRACP-5b。其中TRACP-5b 主要由破骨細胞分泌，故測定血清中的TRACP-5b 活性，可以反映體內OC 活性和骨吸收狀態。目前研究認為TRACP-5b 的活性直接反映了OC 在骨組織中的數量，是反映OC活性的特異性指標，目前已經成為第二代骨吸收生化標志[19]。

本實驗中，我們觀察了苦菜總黃酮對去卵巢豚鼠骨代謝的生化指標影響，實驗結果發現，苦菜總黃酮可改善去卵巢豚鼠骨代謝有關的生化指標，可以提高AKP活性，降低肝組織TrACP-5b活性，說明其可以提高成骨細胞活性，抑制破骨細胞活性，達到改善骨代謝作用。結果提示苦菜總黃酮可通過調節骨代謝水平而改善絕經后婦女因體內雌激素缺乏所導致的骨質疏松癥的可能，但其具體作用機制尚需進一步探討。

總之，苦菜總黃酮對去卵巢成年動物的骨代謝失衡有改善作用，能夠提高成骨細胞數量和功能，產生類雌激素對破骨細胞的抑制作用。通過對成骨細胞和破骨細胞的作用，在整體上對絕經后的高轉換型骨質疏松癥進行改善，降低骨折風險，這為進一步臨床運用提供理論基礎。另外苦菜總黃酮水溶性很好，利用度高，不良反應少，來源天然，價格便宜,因此具有較好的開發前景。

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Effects of total flavonoids in the Sonchus oleraceus L.on biochemical index of bone metabolism in ovariectomized guinea pigs

LIU Yangbin,ZHANG Zhihua

School of Preclinical Medicine,Gannan Medical University,Ganzhou 341000,China

【Abstract】Objective：To observe the effect of the total flavonoids in the Sonchus oleraceus L.on bone metabolism in ovariectomized guinea pig.Methods:Thirty female guinea pigs were randomly divided into 5 groups,namely control group,ovariectomized model group,positive drug group,and difference dosage groups of total favonoids from Sonchus oleraceus L.(0.1 mg/kg or 0.3 mg/kg).One week following ovariectomy,the pigs were intragastrically administrated with saline,estradiol valerate or total favonoids from Sonchus oleraceus L.respectively,once a day for six weeks.Then all pigs were sacrificed,and the sera were obtained to detect the electrolytes,bone gla protein (BGP),calcitonin(CT),alkaline aphosphatase (AKP),and liver tissues were taken to observe the tartrate-resistant acid phosphatase (TrACP-5b).Bone length and mass index were also determined in all pigs.Results:Total favonoids from Sonchus oleraceus L.was capable of increasing the length index of the femur and tibia,improving the calcitonin content,and elevating serum AKP level and reducing liver TrACP-5b content.Conclusion:Total favonoids from Sonchus oleraceus L.can improve bone metabolism in ovariectomized pigs through regulating bone formation and resorption,which indicates that this agent can produce estrogen-like effect and be potential therapeutic results for postmenopausal osteoporosis.

【Key words】Sonchus oleraceus L.；total flavonoids；ovariectomy；guinea pig；bone metabolism

文章編號：1002-0217(2016)03-0210-04

基金項目：江酉省衛生廳科技計劃課題(20122033)

收稿日期：2015-10-08

作者簡介：劉仰斌(1970-)，男，副教授，碩士，(電話)15979776628，(電子信箱)15979776628@163.com．

【文獻標識碼】【中圖號】R 285.5A