芝麻素對自發(fā)性高血壓大鼠腦皮層氧化應(yīng)激損傷的保護作用

盧毅寧，沈媛媛，楊解人

(皖南醫(yī)學(xué)院　藥理學(xué)教研室，安徽　蕪湖　241002)

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

芝麻素對自發(fā)性高血壓大鼠腦皮層氧化應(yīng)激損傷的保護作用

盧毅寧，沈媛媛，楊解人

(皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽蕪湖241002)

【摘要】目的：探討芝麻素(sesamin，Ses)對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)腦皮層神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亞單位p22phox、p47phox蛋白表達的影響。方法：16周齡雄性SHR 35只，隨機分為SHR[(0.5%羧甲基纖維素鈉5 mL/(kg·d)]模型組，Ses高、低[160 mg/(kg·d)、80 mg/(kg·d)]劑量組，卡托普利30 mg/(kg·d)陽性組，每組7只。另設(shè)Wistar-Kyoto(WKY)0.5%羧甲基纖維素鈉5 mL/(kg·d)正常對照組7只，每日給藥1次，連續(xù)灌胃12周。于末次給藥后斷頭取腦，尼氏染色觀察腦皮層神經(jīng)元細胞病理變化并計數(shù)；比色法測定腦皮層組織MDA、H2O2、SOD及T-AOC的含量；硝酸還原酶法測定腦皮層組織NO含量；Western Blot法檢測腦皮層nNOS、p22phox及p47phox蛋白表達。結(jié)果：SHR模型組腦皮層存在組織損傷，神經(jīng)元細胞排列疏松不均，形態(tài)不規(guī)則且細胞數(shù)量減少(P<0.05)；腦皮層組織MDA、H2O2和NO增高，SOD、T-AOC明顯降低(P<0.05或P<0.01)；腦皮層nNOS、p22phox和p47phox蛋白表達上升(P<0.05或P<0.01)。芝麻素給藥12周后，芝麻素高、低劑量組對SHR腦皮層病理性損傷均有不同程度改善，細胞數(shù)目增多(P<0.05或P<0.01)，腦皮層組織MDA、H2O2和NO減少，SOD、T-AOC明顯升高(P<0.05或P<0.01)；腦皮層nNOS、p22phox和p47phox蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：Ses具有改善SHR腦皮層損傷的氧化應(yīng)激作用，其機制與下調(diào)nNOS及p22phox、p47phox蛋白表達有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】芝麻素；腦皮層；神經(jīng)元型一氧化氮合酶；NADPH氧化酶；氧化應(yīng)激

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.03.003

高血壓是常見的威脅人類生命健康的疾病，主要損害人體重要靶器官心、腦、腎及血管。文獻表明[1]，腦部在高血壓狀態(tài)下，會發(fā)生不同程度的腦缺血或出血性病變等高血壓并發(fā)癥,進而引起神經(jīng)細胞損傷和腦血管病變，最終對大腦皮層造成損傷。同時有文獻報道高血壓大鼠腦部存在氧化應(yīng)激狀態(tài)并造成腦損傷[2],提示氧化應(yīng)激在高血壓腦損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，因此尋找具有抗氧化作用的腦保護藥物具有重要意義。芝麻素(sesamin，Ses)是從芝麻中提取的木脂素類化合物，具有降血壓、抗氧化、降血脂等[3-4]作用。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，Ses可以降低腎性高血壓、腎性高血壓伴高脂高糖飲食大鼠血壓并緩解心臟、腎臟等靶器官的損傷[5]，其作用機制與其在靶器官發(fā)揮的抗氧化作用相關(guān)。但關(guān)于Ses對SHR腦皮層損傷的保護作用是否與抗氧化應(yīng)激有關(guān)未見相關(guān)報道。故本研究采用SHR模型，觀察Ses對SHR腦皮層的保護作用，并且通過研究nNOS及NADPH氧化酶亞單位p22phox、p47phox等與氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達來探討其可能機制。

1材料與方法

1.1實驗動物16周齡雄性SHR 35只和WKY 7只，體質(zhì)量(340±20)g，許可證號:SCXK(滬)2007-0005，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。單籠飼養(yǎng)，保持溫度22～25 ℃，相對濕度60%～70%，自然光照，定時進食和飲水，飼料購于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。

1.2藥品和試劑芝麻素(純度93.7%)，分子式為C20H15O6，分子量354.34，批號P0315(北京興百祥科貿(mào)有限公司)。卡托普利(captopril，Cap)，25 mg/片，批號:09102411(常州制藥有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD，編號：S0107)、總抗氧化能力(T-AOC，編號：S0116)、丙二醛(MDA,編號：S0131)、過氧化氫(H2O2，編號：S0038)、一氧化氮(NO，編號：S0021)及BCA蛋白檢測試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。nNOS抗體，編號：BA0360(武漢博士德生物科技有限公司)、p22抗體，編號：sc-20781、p47抗體，編號：sc-86190(Sant Cruz公司)。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，編號：A0208，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，編號：A0216，Tubulin抗體，編號:AT819(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。氟化聚偏乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)微孔轉(zhuǎn)移膜(美國Millipore公司)。

1.3實驗分組及給藥雄性16周齡SHR 35只，WKY 7只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。SHR隨機分組：SHR[0.5%羧甲基纖維素鈉5 mL/(kg·d)，n=7]模型組、Ses高劑量[160 mg/(kg·d)，n=7]組、Ses低劑量[80 mg/(kg·d)，n=7]組、Cap[30 mg/(kg·d)，n=7]陽性對照組。另設(shè)WKY[0.5%羧甲基纖維素鈉5 mL/(kg·d)，n=7]正常對照組。每日下午5時灌胃給藥1次，連續(xù)12周。

1.4標(biāo)本采集與組織處理于末次給藥后，大鼠禁食12 h，麻醉，斷頭取腦。取每組大鼠左腦，以冠狀面切分為4段，分別置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于石蠟包埋；另取每組大鼠右腦皮層置于1.5 mL EP管中，用于制備10%組織勻漿；并將剩余腦皮層-80 ℃保存，用于Western blot實驗。

1.5尼氏(Nissl)染色常規(guī)石蠟切片(5 μm)，放入60 ℃烘箱烤干2 h后，常規(guī)脫蠟至水。加入尼氏染色液5 min后，用蒸餾水沖洗兩次后常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察大鼠腦皮層神經(jīng)元細胞的變化，隨后選取每組腦皮層各區(qū)切片，隨機選取5個視野，在400倍光鏡下進行細胞計數(shù)，取其均數(shù)進行分析。

1.6生化指標(biāo)測定BCA法測定組織蛋白濃度。按試劑盒說明書分別以黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸比色法、二甲酚橙比色法和ABTS法測定腦組織勻漿SOD、MDA、H2O2和T-AOC的含量，硝酸還原酶法測定腦皮層組織勻漿中NO含量。

1.7Western Blot法檢測腦皮層nNOS、p22phox和p47phox蛋白低溫提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣60 μg蛋白，10%SDS-PAGE分離樣品，轉(zhuǎn)膜，封閉，再分別滴加Tubulin(1∶1000)、nNOS(1∶200)及p22phox(1∶500)、p47phox(1∶200)一抗4 ℃過夜。洗膜，二抗(1∶2000)室溫孵育2 h。洗膜后將高靈敏的ECL化學(xué)發(fā)光劑加到膜的正面，暗室壓片曝光、顯影。膠片掃描后用Image J 1.43軟件統(tǒng)計各組集成光密度值，并統(tǒng)計分析比較各組蛋白表達差異。

2結(jié)果

2.1Ses對SHR腦皮層的病理組織學(xué)影響尼氏染色結(jié)果顯示，WKY組腦皮層神經(jīng)元細胞染色清晰，排列緊密、規(guī)則，形態(tài)完整；與WKY組相比，SHR模型組腦皮層神經(jīng)元細胞排列疏松不均，形態(tài)不規(guī)則，且細胞數(shù)量減少(P<0.05)，細胞空染或淡染；與SHR組相比，Ses高、低劑量組及Cap組腦皮層神經(jīng)元細胞排列較緊密，形態(tài)較規(guī)則，細胞空染或淡染均有不同程度的減少，其中Ses高劑量組細胞數(shù)量顯著上升(P<0.05)。提示Ses具有改善SHR皮層損傷的作用(見圖1，表1)。

A.WKY; B.SHR; C.Ses 80 mg/kg; D.Ses 160 mg/kg; E.Cap 30 mg/kg。

圖1Ses對SHR皮層的影響(尼氏染色,×400)

GroupDose/(mg/kg)神經(jīng)元細胞數(shù)WKY-144.00±19.78SHR-73.63±12.38*+Ses8078.29±2.81+Ses160116.00±6.51#+Cap3082.51±2.77F值10.632P值<0.01

*P<0.05，**P<0.01vsWKY;#P<0.05，##P<0.01vsSHR。

2.2芝麻素對SHR腦皮層組織勻漿T-AOC、SOD、MDA和H2O2的影響與WKY組相比，SHR模型組腦皮層組織勻漿MDA和H2O2含量明顯升高(P<0.05)，SOD和T-AOC含量明顯降低(P<0.05)；與SHR模型組相比，Ses高、低劑量組及Cap組腦皮層MDA及H2O2含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)，SOD和T-AOC含量明顯升高(P<0.05或P<0.01)。提示Ses具有抗SHR腦皮層氧化應(yīng)激的作用(見表2)。

Group/(mg/kg)T-AOC/(U/mgprot)SOD/(mmol/gprot)MDA/(μmol/gprot)pO2/(μmol/gprot)WKY4.97±0.23138.70±15.0211.40±1.33132.10±5.36SHR3.71±0.20**72.60±6.82**35.29±6.79**257.50±37.90*+Ses(80)4.41±0.13#105.90±9.49#17.21±2.51#208.90±31.22+Ses(160)4.85±0.25##130.60±12.50##11.55±1.96##138.60±5.84#+Cap(30)4.83±0.12##128.80±12.76##10.99±1.84##111.40±8.44##F值14.94711.20918.34915.337P值<0.01<0.01<0.01<0.01

*P<0.05，**P<0.01vsWKY;#P<0.05，##P<0.01vsSHR。

2.3芝麻素對SHR腦皮層組織勻漿NO的影響與WKY組相比，SHR組腦皮層組織中NO含量明顯上升(P<0.05)。與SHR組相比，Ses[160 mg/(kg·d)]組和Cap 組均有不同程度下降(P<0.05)，提示Ses可以降低SHR腦皮層中NO含量(見圖2)。

2.4Ses對SHR腦皮層nNOS蛋白表達的影響與WKY組相比，SHR組腦皮層組織nNOS蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)；與SHR組相比，Ses 高、低劑量組和Cap 組nNOS蛋白表達均顯著下調(diào)(P<0.01)。提示Ses可以下調(diào)SHR腦皮層nNOS蛋白的表達(見圖3)。

*P<0.05，**P<0.01vsWKY; #P<0.05，##P<0.01vsSHR。

*P<0.05，**P<0.01vsWKY; #P<0.05，##P<0.01vsSHR。

2.5Ses對SHR腦皮層p22phox和p47phox蛋白表達的影響與WKY組相比，SHR組腦皮層p22phox和p47phox蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)；與SHR組相比，Ses 高、低劑量組和Cap組腦皮層p22phox和p47phox蛋白的表達不同程度地下調(diào)(P<0.05或P<0.01)。提示Ses具有下調(diào)SHR腦皮層p22phox和p47phox蛋白的作用(見圖4)。

*P<0.05，**P<0.01vsWKY; #P<0.05，##P<0.01vsSHR。

3討論

研究表明長期的高血壓可導(dǎo)致SHR腦血管、腦皮層等部位發(fā)生結(jié)構(gòu)形態(tài)、組織代謝的損傷[6]，國外研究發(fā)現(xiàn)高血壓對SHR腦皮層功能造成嚴(yán)重危害并引起紊亂[7]。通過對飼養(yǎng)28周后的SHR腦皮層組織進行尼氏染色觀察其形態(tài)改變發(fā)現(xiàn)其腦皮層中神經(jīng)元細胞形態(tài)不規(guī)則，排列疏松不均，且細胞數(shù)量減少，證實了高血壓可引起SHR腦皮層發(fā)生損傷。當(dāng)SHR每天進行1次Ses灌胃給藥，給藥12周后，不同Ses劑量組大鼠腦皮層組織損傷得到不同程度改善，且細胞數(shù)得到不同程度恢復(fù)，提示Ses具有改善SHR腦皮層損傷的作用。

當(dāng)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生遠高于氧化防御體系的保護能力時，體內(nèi)自由基與抗氧化物質(zhì)的平衡被打破，就會導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激并引起損傷[8]。文獻結(jié)果顯示，SHR大鼠腦組織自由基生成過多,抗氧化防御能力和自由基清除能力下降[9-10],最終導(dǎo)致SHR大鼠腦部發(fā)生氧化應(yīng)激。國外研究發(fā)現(xiàn)，高血壓大鼠腦皮層存在氧化應(yīng)激[11]。因此本課題組制備腦皮層組織勻漿，發(fā)現(xiàn)SHR腦皮層組織自由基指標(biāo)MDA和H2O2含量明顯高于WKY組，證明SHR腦皮層存在大量自由基；同時發(fā)現(xiàn)SHR組大鼠腦皮層抗氧化能力指標(biāo)SOD活性和T-AOC能力明顯低于WKY組，提示SHR腦皮層清除自由基和總抗氧化能力明顯減弱，說明腦皮層存在氧化應(yīng)激狀態(tài)。經(jīng)Ses治療12周后，SHR腦皮層組織MDA和H2O2含量明顯降低，SOD活性和T-AOC能力明顯提高，提示Ses可改善SHR腦皮層的氧化應(yīng)激狀態(tài)。但Ses具體是通過何種途徑改善SHR腦皮層的氧化應(yīng)激，有待于進一步研究。故本課題組采用硝酸還原酶法測定腦皮層NO含量，同時用免疫印跡方法檢測nNOS及NADPH氧化酶亞基蛋白表達，從nNOS-NO通路及NADPH氧化酶亞基p22phox和p47phox途徑，探索Ses保護SHR腦皮層氧化應(yīng)激損傷的可能機制。

文獻報道，在對SHR腦損傷的研究中發(fā)現(xiàn)持續(xù)的高血壓狀態(tài)可最終導(dǎo)致nNOS過量表達，并催化精氨酸產(chǎn)生過量NO[12]。過量的NO可與超氧陰離子(O2-)反應(yīng)生成過氧亞硝基陰離子(ONOO-)等自由基進而引起氧化應(yīng)激損傷。本實驗結(jié)果表明，SHR腦皮層組織中NO含量顯著增高，且nNOS蛋白表達明顯上調(diào)，表明SHR腦皮層nNOS蛋白過表達并生成過量NO，造成腦皮層氧化應(yīng)激損傷。經(jīng)Ses給藥治療后，SHR腦皮層組織內(nèi)NO含量下降，nNOS蛋白表達明顯下調(diào)，說明Ses可下調(diào)nNOS蛋白表達并抑制NO產(chǎn)生，調(diào)節(jié)nNOS-NO通路，改善SHR腦皮層氧化應(yīng)激。

NADPH 氧化酶是體內(nèi)氧化應(yīng)激的另一重要來源,包括p22phox和gp91phox以及p47phox、p67phox等各種亞單位。在病理狀態(tài)或大量有害物質(zhì)聚集等條件作用下,NADPH 氧化酶被激活從而造成高血壓大鼠腦部自由基進一步蓄積[13]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHR腦皮層p22phox、p47phox蛋白表達均顯著上升，經(jīng)Ses治療后，SHR腦皮層p22phox、p47phox蛋白表達均不同程度下降，提示Ses可下調(diào)腦皮層p22phox、p47phox蛋白表達，調(diào)節(jié)NADPH氧化酶亞基p22phox和p47phox途徑引起的氧化應(yīng)激。

綜上所述，芝麻素可能通過抑制腦皮層nNOS-NO和NADPH氧化酶亞基p22phox、p47phox所介導(dǎo)通路，降低腦皮層自由基含量，提高其抗氧化能力，進而對自發(fā)性高血壓大鼠腦皮層氧化應(yīng)激損傷起到改善作用，但其確切機制有待進一步研究。

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Antioxidative effect of sesamin on the cerebral cortex protection in spontaneous hypertensive rats

LU Yining,SHEN Yuanyuan,YANG Jieren

Department of Pharmacology，Wannan Medical College，Wuhu 241002，China

【Abstract】Objective：To investigate the effect of sesamin on nNOS,NADPH oxidase subunits p22phox and p47phox expression at the cerebral cortex in spontaneous hypertensive rats(SHR).Methods:Forty male SHRs,aged 16 weeks,were randomized into groups of SHR model，n=7,treated with 0.5% sodium carboxymethyl cellulose in dose of 5 mL/(kg·d),sesamin treatment group by diverse dosage 80 mg/(kg·d) and 160 mg/(kg·d),n=7 for each dosage,and captopril intervention group，30 mg/(kg·d),n=7.Another 7 Wistar-Kyoto(WKY) rats were included as negative controls treated with 0.5% sodium carboxymethyl cellulose in dose of 5 mL/(kg·d).All rats were intragastrically administrated with the drugs once a day for consecutive 12 weeks,and the brain tissues were obtained after final treatment.Nissl′s staining was used to detect changes of the cortex neurons in rats in each group.MDA,H2O2,SOD,T-AOC levels and NO content in the cortex homogenate and the expression of nNOS,p22phox and p47phox protein were determined respectively by,colorimetry,nitrate reductase method and Western blot.Results:Damaged cerebral cortex was seen in SHR models.The neurons were in loose arrangement and irregular in shape,with reduced cells.However,sesamin treatment had significantly relieved the neuron damage at cerebral cortex and promoted the number of neuron in different cortex regions(P<0.05 or P<0.01),and markedly reduced the levels of MDA,H2O2,SOD and NO amount in cortex homogenate(P<0.05 or P<0.01).The expression of nNOS,p22 phox and p47phox protein was greatly reduced and the SOD and T-AOC levels were notably improved in cortex homogenate in SHR rats(P<0.05 or P<0.01).Conclusion:Sesamin may produce antioxidative effect on the damage of cerebral cortex in SHRs.The mechanism may be associated with decreased expression of nNOS,p22phox and p47phox protein.

【Key words】sesamin;cerebral cortex;nNOS;NADPH oxidase;oxidative stress

文章編號：1002-0217(2016)03-0214-05

基金項目：安徽省自然科學(xué)基金項目(1308085QH145)

收稿日期：2015-12-14

作者簡介：盧毅寧(1990-)，男，2013級碩士研究生，(電話)15212244260，(電子信箱)815471692@qq.com；

【文獻標(biāo)識碼】【中圖號】R 285;R 544.1A

楊解人，女，教授，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱)jryang1955@sina.com，通訊作者.