血必凈對脂多糖誘導的急性肺損傷大鼠肺組織細胞間粘附分子-1表達的影響

張之齡，沈琪琦，朱健，童小文，徐兵，周吳剛

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院急診科，上海　200011)

?

·基礎研究·

血必凈對脂多糖誘導的急性肺損傷大鼠肺組織細胞間粘附分子-1表達的影響

張之齡，沈琪琦，朱健，童小文，徐兵，周吳剛

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院急診科，上海200011)

目的觀察血必凈對脂多糖誘導的急性肺損傷(ALI)大鼠細胞間粘附分子-1(ICAM-1)表達的影響。方法將45只Wistar 大鼠采用隨機數字表分為三組：(1)健康對照(Control)組(15只)、(2)脂多糖 (LPS)組(15只)、(3) 血必凈(XBJ)組 (15只)。LPS組和XBJ組采用股靜脈注射LPS(5 mg/kg)制備大鼠ALI模型。造模前半小時開始給藥，XBJ組給予血必凈4 mL/kg；Control組和LPS組則給予等容積0.9%氯化鈉注射溶液。在造模后6 h、12 h、24 h各隨機處死大鼠5只，分別作為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞組，光鏡下觀察肺臟組織形態學變化，免疫組織化學法(IHC)檢測肺組織中ICAM-1蛋白表達。結果造模后LPS組隨著實驗時間的延長，肺組織ICAM-1蛋白呈逐漸增加趨勢，至24 h達到高峰。與LPS組相比，血必凈組各時間點肺組織ICAM-1蛋白表達明顯降低(P

急性肺損傷；膿毒癥；胞間黏附分子1 ；大鼠,Wistar

膿毒癥目前依然是ICU患者最主要的死亡原因，嚴重時可并發急性肺損傷(ALI)和多器官衰竭(MOF)。最新的流行病學調查結果[1]顯示ALI患者死亡率在34%至58%之間，因此，尋找新的ALI發病的分子機制及治療策略刻不容緩。雖然ALI的具體發病機制仍不明確，但研究[2]發現細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的黏附功能和炎性反應及其相互關系是導致ALI的主要因素，與炎癥性疾病有著十分密切的關系，在ALI/ARDS的發生和發展過程中起重要作用。有研究[3-4]認為針對ICAM-1進行干預將有利于炎癥的恢復。本實驗通過觀察血必凈注射液對ALI 模型大鼠肺組織ICAM-1表達的影響，探討其可能的保護作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康雄性Wistar大鼠45只，2.5～3.5月齡，體質量250～280 g/只，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供[生產許可證號：SCXK(滬)2008-0016]。

1.2實驗藥品和試劑血必凈注射液(10 mL/支，天津紅日藥業有限公司產)；脂多糖(LPS,Escherichia coliO127:B8,L3129，Sigma，美國)；ICAM-1羊抗大鼠多克隆抗體(Santa Cruz，美國)。

1.3方法

1.3.1實驗動物分組、模型建立及給藥方法腹腔注射10%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉后固定，經大鼠股靜脈注射LPS(5 mg/kg)。45只SPF級雄性成年Wistar大鼠采用隨機數字表分為三組：(1)健康對照組(n=15)、(2)脂多糖組(LPS組，n=15)、(3)血必凈干預組(XBJ組，n=15)。血必凈組在造模前半小時靜脈內給予血必凈4 mL/kg，健康對照組和LPS組則給予等容積0.9%氯化鈉注射溶液。在造模后6 h、12 h、24 h各隨機處死大鼠5只，分別作為I、Ⅱ、Ⅲ亞組，無菌留取大鼠肺組織。

1.3.2標本制備在造模后6 h、12 h、24 h各隨機處死大鼠5只，分別作為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞組，取右肺上、下葉組織置入4%多聚甲醛固定，制作組織病理切片和免疫組織化學染色切片用于病理學檢查。

1.3.3免疫組織化學法(IHC)檢測肺組織中ICAM-1蛋白表達采用SP法檢測肺組織中ICAM-1蛋白表達。肺組織經石蠟包埋作5 μm厚度的切片常規脫蠟至水，0.3%H2O2甲醇溶液消除內源性過氧化物酶，正常羊血清封閉，滴加一抗(羊抗大鼠ICAM-1多克隆抗體,濃度 1∶50)。PBS漂洗后滴加辣根過氧化物酶標記的兔抗羊二抗，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗后二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精染色。光鏡觀察并應用Image pro Plus5.1圖像處理系統采集圖片對結果進行半定量分析，每張切片隨機選5個不重復的視野，放大400倍，計算ICAM-1陽性染色的積分吸光度值(IOD)，分別取其平均值進行分析。

1.4統計學處理采用SPSS13.0軟件包分析，多組均數采用單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK法。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1肺組織的病理形態學變化健康對照組大鼠肺組織結構完整，肺泡腔清晰，肺泡間隔無炎癥、無水腫。且各時間點無明顯差異；LPS組大鼠肺組織結構基本毀損，肺泡間隔增寬，部分肺泡內見滲出、水腫、出血及纖維蛋白沉積，肺間質見大量炎癥細胞浸潤。且隨時間點增長而明顯。XBJ組大鼠肺組織肺泡隔略有增寬，肺泡內滲出、水腫、出血情況有所改善，肺間質見少量炎癥細胞浸潤。

2.2肺組織ICAM-1蛋白的表達正常大鼠肺組織微弱陽性表達ICAM-1,僅少量分布于肺泡上皮細胞。LPS組肺組織ICAM-1強陽性表達，主要分布于肺泡上皮和肺血管內皮細胞。XBJ組肺組織ICAM-1陽性表達減輕。圖像分析軟件測定的積分吸光度值提示，LPS 各亞組較健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，XBJ各亞組較LPS組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　三組大鼠不同時間點肺組織ICAM-1的免疫組織化學表達

注：表中為IOD值；與對照組同時間點比較,aP<0.05；與LPS組同時間點比較,bP<0.05

3　討論

膿毒癥常在感染和手術應激情況下發生，其本質為大量細胞因子和炎性介質釋放后引起宿主自身免疫損傷進而導致多器官功能障礙綜合征。流行病學調查顯示，膿毒癥與諸多免疫信號通路異常激活有密切的關系。有研究證實，臨床上超過60%膿毒癥患者的致病菌為革蘭陰性菌[5]，而啟動免疫反應的LPS是革蘭陰性菌細胞壁釋放的重要成分。LPS與細胞表面受體結合后，激活了一系列免疫信號通路，同時分泌大量炎性因子，最終導致機體發生失控的炎性反應[6]。目前，膿毒癥確切的分子發病機制還不清楚。

ALI是膿毒癥最主要的器官并發癥[7]。由于膿毒癥引起機體免疫功能受損，致使大量處于極度活躍狀態的炎癥細胞諸如巨噬細胞和中性粒細胞釋放的炎性介質和細胞因子進一步加重肺組織及肺毛細血管內皮損傷。因此，深入研究膿毒癥誘導肺損傷的發病機制對于臨床治療ALI至關重要。

ICAM-1又名 CD54,是免疫球蛋白超家族類的成員之一，是一種重要的細胞表面粘附分子[8]，其參與介導中性粒細胞與上皮細胞或血管內皮細胞的粘附，在炎性反應的發生發展過程中具有不可替代的作用。作為粘附分子家族的重要成員之一，ICAM-1在重癥急性胰腺炎早期即顯著升高，并與急性肺損傷的發生有密切的關系，提示 ICAM-1可能在危重病時介導了炎癥網絡的形成。在各種ALI/ARDS動物模型中發現，ICAM-1在肺泡上皮細胞和血管內皮細胞膜表面大量并持久表達，并且ICAM-1的表達量與肺損傷的嚴重程度呈正相關[9-10]。有研究表明，經 ICAM-1基因敲除處理后的小鼠，可阻斷PMN與內皮細胞的粘附，進而減輕肺組織的損傷；應用 ICAM-1單克隆抗體阻斷ICAM-1形成，可減輕LPS引起的肺、腎、肝等多器官損傷[11]。全身的炎性反應及致病因子對肺血管內皮細胞的直接損傷是ALI的發病機制中最主要的環節。中性粒細胞(PMN)、巨噬細胞等炎癥細胞和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥介質以及它們與血管內皮細胞的相互作用[12-13]貫穿了全身炎性反應的整個過程，而ICAM-1 在細胞與細胞粘附的相互作用過程中起重要作用。如能有效地控制ICAM-1的過度表達，對ALI的治療具有重要意義。

血必凈是由中藥赤芍、川芎、丹參、紅花、當歸的提取物組成的復方中藥靜脈制劑，具有很好活血化瘀、疏通絡脈、潰散毒邪的作用。臨床上被廣泛應用于治療膿毒癥。多項研究證實血必凈是一種有效的抗炎藥物，能增強annexin A1表達并抑制白介素(IL)-1，6，8，23和TNF-α等促炎因子的生成[14-16]。王煜霞等[17]發現血必凈能顯著抑制缺血再灌注家兔肺組織ICAM-1釋放,提高家兔的動脈氧分壓。顧滔[18]在對復蘇綜合征患者的臨床研究中發現血必凈可有效下調ICAM-1等炎癥介質的過量表達，從而抑制機體過度炎性反應，提高患者的30 d存活率。

本實驗采取LPS靜脈內注射的方式造模。本實驗病理學觀察發現肺泡間隔增寬，肺泡腔出血，間質內大量炎細胞浸潤，提示成功建立了ALI的動物模型。本實驗采用免疫組織化學方法檢測的研究結果顯示，同時間點LPS組的肺組織ICAM-1蛋白表達量顯著高于正常組，且呈逐漸上升趨勢，結合對膿毒癥大鼠的肺組織病理學觀察等結果，發現 ICAM-1蛋白表達水平與肺組織的病理損害程度基本一致。提示ICAM-1 可能在脂多糖誘導ALI的過程中具有重要作用,與 Beck-Schimmer等[19]的結果相吻合。

本實驗前期研究[20-21]發現，血必凈可以有效減輕ALI 時肺組織的炎性反應。為了進一步研究血必凈對ALI大鼠的保護作用機制，本研究擬從分子機制上探討其對肺組織局部ICAM-1表達的影響。研究結果顯示，血必凈可通過抑制ICAM-1的表達,進而減少炎性因子的釋放和炎性反應的擴大，減輕肺組織炎性反應，從而實現對膿毒癥誘導肺損傷的保護作用，為臨床救治急性肺損傷提供了新思路。

[1]MacCallum NS,Evans TW.Epidemiology of acute lung injury[J].Current Opinion in Critical Care,2005，11(1): 43-49.

[2]Mondrinos MJ,Zhang T,Sun S,et al.Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCδ) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation[J].Am J Pathol，2014,184(1):200-213.

[3]Hou S,Ding H,Lv Q,et al.Therapeutic effect of intravenous infusion of perfluorocarbon emulsion on LPS-induced acute lung injury in rats[J].PLoS ONE,2014,9(1):e87826.

[4]Theobaldo MC,Llimona F,Petroni RC,et al.Hypertonic saline solution drives neutrophil from bystander organ to infectious site in polymicrobial sepsis: a cecal ligation and puncture model[J].PLoS ONE,2013,8(9):e74369.

[5]王強.JAK/STAT信號通路對膿毒癥大鼠腫瘤壞死因子-α表達的影響及意義[D].西安：第四軍醫大學，2001.

[6]Durosier LD,Herry CL,Cortes M,et al.Does heart rate variability reflect the systemic inflammatory response in a fetal sheep model of lipopolysaccharide-induced sepsis?[J].Physiol Meas,2015，36 (10)：2089-2102.

[7]Filgueiras LR,Martins JO,Serezani CH,et al.Sepsis-induced acute lung injury (ALI) is milder in diabetic rats and correlates with impaired NFkB activation[J].PLoS One,2012，7(9):e44987.

[8]Arnson Y,Shoenfeld Y,Amital H.Effects of tobacco smoke on immunity,inflammation and autoimmunity[J].J Autoimmun,2010,34(3): 258-265.

[9]Chunsheng L，Peichun G，Xinhue H.Expression of intercellular adhesion molecule in lung tissues of experimentaI：acute lung injury and the affect of Rhubarb on it[J].Chin Med Sci，2000，5(1)：93-97.

[10] Zhou Q，Bai M.Intercellular adhension molecule-1 in the pathogenesis of heroin-induced acute lung injury in rats[J].J Hnazhong Univ Sci Teehnolog Med Sci，2004,241(5):430-432.

[11] 閆文生，闞文宏，黃巧冰，等.脂多糖誘導小鼠臟器中細胞間黏附分子l的表達[J].生理學報，2002，54(1)：71-74

[12] 羅昆侖,何振平.中性粒細胞介導組織損傷的機制[J].國外醫學:生理、病理科學與臨床分冊，1999,19(1) : 51-54.

[13] Siblle Y,Reynolds Y.Macrophages and polymorphonuclear neutrophils in lung defense and injury[J].Am Rev Respir Dis,1990,141(2):471-501.

[14] He XD,Wang Y,Wu Q,et al.Xuebijing protects rats from sepsis challenged with Acinetobacter baumannⅡ by promoting annexin A1 expression and inhibiting proinflammatory cytokines secretion[J].Evid-based Compl Alt,2013:11.

[15] Jiang M,Zhou M,Han Y,et al.Identification of NF-κB Inhibitors in Xuebijing injection for sepsis treatment based on bioactivity-integrated UPLC-Q/TOF[J].J Ethnopharmacol,2013,147(2):426-433.

[16] Sun J,Xue Q,Guo L,et al.Xuebijing protects against lipopolysaccharide-induced lung injury in rabbits[J].Exp Lung Res,2010,36(4):211-218.

[17] 王煜霞，王雷，姬明麗.血必凈注射液對家兔左心缺血再灌注損傷肺臟的保護作用[J].河南師范大學學報(自然科學版)，2013,41(6)：127-129.

[18] 顧滔.血必凈注射液對復蘇后綜合征血液流變學和凝血功能的影響[J].環球中醫藥，2013，6(S1)：97-98.

[19] Beck-schimmer B,Schimmer RC,Warner RL,et al.Expression of lung vascular and airway ICAM- 1 after exposure to bacterial lipopolysaccharide[J].Am J Respir Cell Mol Biol,1997,17(2):344-352.

[20] 張之齡，尹小燕，童小文，等.血必凈對脂多糖誘導的急性肺損傷大鼠肺組織高遷移率族蛋白1表達的影響[J].中國臨床保健雜志，2011，14(4)：395-397.

[21] 張之齡，童小文，徐兵，等.血必凈對脂多糖誘導急性肺損傷大鼠的保護作用[J].中國臨床保健雜志，2014，17(4)：373-375.

Effect of Xuebijing on expression of ICAM-1 in the lung tissue of rats with acute lung injury induced by lipopolysaccharide

ZhangZhiling，ShenQiqi，ZhuJian，TongXiaowen，XuBing，ZhouWugang

(DepartmentofEmergentMedicine,AffiliatedNinthPeople'sHospital，SchoolofMedicine，ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200011，China)Correspondingauthor:ShenQiqi，Email：shen＿qiqi@21cn.com

ObjectiveTo observe the effect of Xuebijingon expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)in the lung tissue of rats with acute lung injuryinduced by lipopolysaccharide.MethodsForty-five Wistar rats were randomly divided into 3 groups byrandom number table method：(1)control group(n=15)，(2)LPS group(n=15)，(3) Xuebijing group(XBJ group) (n=15).Injection of LPS(5 mg/kg) into femoral vein to reproduce ALI model in LPS group and XBJ group.Male Wistar rats of XBJ group were given XBJ 4 mL/kg 30 min before the intravenous injection of LPS,whereas control group and LPS group were given equivalent volume normal saline.Five rats in each group were killed at 6 h,12 h and 24 h，which were divided into subgroup I,Ⅱ,Ⅲ.The pathomorphism changes of lung tissue were observed by light microscope，and expression of ICAM-1 in pulmonary was examined by immunohistochemistry.ResultsExpression of ICAM-1 were gradually increased with experimental time prolonged and reached the peak at 24h in LPS group after establishing model.ICAM-1 were significantly lower in XBJ group than LPS group at each time points (P<0.05).Compared to LPS group,the pathological change was significantly reduce in XBJ group under microscope.ConclusionXuebijing can inhibit the expressions of ICAM-1 and reduce acute lung injury induced by lipopolysaccharide in the lung tissue of rats.

Acute Lung injury；Sepsis；Intercellular adhesion molecule-1 ；Rats,Wistar

張之齡，副主任醫師，Email：zhangzhiling1970@163.com

沈琪琦，副主任醫師，Email：shen＿qiqi@21cn.com

R563.8

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2016.04.022

2016-02-16)