海馬RAGE和BACE異常表達與SHR認知功能損害相關性研究*

西安交通大學第一附屬醫院神經內科(西安710061)

喬　晉　王新陽△　陸文慧　秦　星

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海馬RAGE和BACE異常表達與SHR認知功能損害相關性研究*

西安交通大學第一附屬醫院神經內科(西安710061)

喬晉王新陽△陸文慧秦星

摘要目的：探討自發性高血壓大鼠海馬β淀粉樣蛋白(Aβ)代謝通路的變化，揭示Aβ代謝通路異常在高血壓認知損害中的意義。方法： 以SHR和WKY大鼠為研究對象，使用RT-PCR和Western blot方法分別檢測SHR及WKY海馬RAGE、LRP-1、APP和BACE 的mRNA及蛋白質表達水平。結果：與WKY大鼠相比，SHR海馬組織RAGEmRNA、BACEmRNA的表達水平明顯增高(P<0.05)，而APP mRNA表達水平相對降低(P>0.05),LRP-1mRNA表達水平相對增高(P>0.05);與WKY大鼠相比，SHR海馬組織RAGE、BACE的表達水平明顯增高(P<0.05)，而APP和LRP-1表達水平相對增高(P>0.05)。結論: SHR海馬RAGE和BACE的mRNA及其蛋白表達水平異常增高，提示Aβ代謝異常可能參與了高血壓認知損害的發生機制。

主題詞高血壓/病理生理學認知障礙淀粉樣前蛋白分泌酶@高級糖基化終末產物受體低密度脂蛋白受體相關蛋白-1大鼠

β-淀粉樣蛋白 (β-amyloidprotein,Aβ) 異常沉積是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)病理的主要環節，是AD發病的關鍵因素和治療靶點。Aβ是阿爾茨海默病老年斑的主要成分，其來源于淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein ，APP)的裂解。β-分泌酶(β- amyloid precursor protein cleaving enzyme ，BACE )是APP裂解過程中產生Aβ的主要限速酶。高級糖基化終末產物受體(Receptor for advanced glycation end products， RAGE)和低密度脂蛋白受體相關蛋白-1( Low-density lipid protein receptor-related potein-1，LRP-1)是負責Aβ的跨血腦屏障轉運。大量流行病學證據表明血管病性危險因素在AD發病中扮演著重要角色,可以促使AD的發生和加速AD臨床惡化[1]。高血壓是最常見的心腦血管病危險因素，也是AD發病的重要危險因素。血管病危險因素可以造成老年人認知障礙的發生，但其導致認知損害的發生機制復雜，特別是高血壓在AD發病中的作用尚未完全闡明，導致認知損害的發生是否與淀粉樣蛋白的異常代謝有關，目前尚不明確。因此探索高血壓大鼠Aβ代謝途徑的變化，對于闡明在高血壓在AD發病中的作用具有重要價值,為AD的防治提供新的理論基礎。

材料和方法

1主要試劑及儀器APP抗體、BACE抗體和GAPDH抗體購自美國Cell Signal公司；HRP-抗兔IgG 和HRP-抗小鼠IgG購自美國Santa Cruz公司。Western 印跡檢測試劑盒購自武漢博士德公司。Trizol試劑購自美國Inv itrogen公司, RT-PCR 試劑盒購自立陶宛Fermentas公司

2方法

2.1實驗動物和標本處理

2.1.1動物:Spontaneously Hypertensive Rat SHR(14～15w)和WKY Wistar Kyoto rat大鼠(8～10周)各10只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，在西安交通大學醫學實驗動物中心清潔飼養到18～20周。飼養溫度(24 ±2)℃,濕度(50±10)%,大鼠自由進水、進食。實驗過程中SHR死亡1只

2.1.2動物處死和標本留取：腹腔注射10%水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉動物,麻醉成功后仰臥位固定于手術板上，打開胸腔，暴露心臟，從左心室把玻璃插管插至主動脈根部，用絲線結扎以防脫落，眼科剪剪開右心房放血，經左心室主動脈插管快速灌注生理鹽水100 ml。然后斷頭取腦，分離兩側海馬組織，稱重，編號，液氮罐儲存，按待測指標要求留取海馬組織待檢。

2.2RT-PCR檢測：取50～100 mg 冰凍的海馬組織，Trizol一步法提取總RNA后，計算所提取RNA的A260/280值，電泳后紫外燈下觀察RNA 樣本的完整性。再按說明書操作反轉錄成cDNA, 取2μl進行后續25μl體系 PCR反應 , 擴增目的基因片段。委托上海捷瑞生物工程公司合成5對引物APP、BACE、RAGE、LRP-1和內參照GAPDH。APP上游引物：5′-GGATGCGGAGTTCGGACATG -3′，下游引物5′-GTTCTGACTCTGCTCAAAG-3′；BACE上游引物：5′-GATGGTGATGCGGAAGGACTGATT-3′，下游引物： 5′-CCGGCGGGAGTGGTATTATGAAGT-3′； RAGE上游引物：5′-CAGGGTCACAGAAACCGG-3′， 下游引物：5′-ATTCAGCTCTGCACGTTCCT-3′；LRP-1上游引物：5′-GAGTGTTCCGTGTATGGCAC-3′ ，下游引物：5′-GATGCCTTGGATGATGGTC-3′；GAPDH上游引物：5′-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3′，下游引物：5′- ATG TCACGCACGATTTCCCGC - 3′。按照美國Cell signaling公司提供的TRizol試劑盒說明步驟提取RNA,然后進行逆轉錄和PCR擴增: ①逆轉錄:按照立陶宛Fermentas公司試劑盒上說明操作:逆轉錄條件為: 25℃, 10 min; 42℃, 60 min； 70℃, 10 min; ② PCR的條件是: APP：94℃預變性5min，94℃變性30s， 52℃退火45s，72℃延伸45s，30個循環后，72℃最終延伸7min。BACE:94℃預變性5min，94℃變性30s，60℃退火45s,72℃延伸45s，30個循環后; 72℃最終延伸7min。RAGE:94℃預變性5min，94℃變性30s，53℃退火45s，72℃延伸45s，30個循環后， 72℃最終延伸7min。 LRP-1:94℃預變性5min，94℃變性30s;51℃退火45s， 72℃延伸45s，35個循環后 ,72℃最終延伸7min。終產物片段長度分別為298、 322、214、768和500bp。 PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳, 上樣總量為15μl (擴增產物樣品量10μl、5μl DNA Marker)，并在Bio-RAD凝膠成像分析儀上進行分析。以APP/GAPDH、BACE/GAPDH、RAGE/GAPDH、LRP-1/GAPDH的PCR產物的灰度值比值代表APPmRNA、BACEmRNA、mRNA、LRP-1mRNA表達水平。

2.3Western blot檢測：取50～100mg海馬組織進行蛋白的提取,并按照Bradford試劑盒測定蛋白的濃度。取蛋白樣品30μg,經過SDS-PAGE電泳后,將凝膠中蛋白電轉移至PVDF膜, 以5%脫脂奶粉TBST液封閉后,分別加入I抗APP抗體、BACE抗體、RAGE抗體、LRP-1抗體、GAPDH抗體，4℃孵育1.5h,洗滌后加入Ⅱ抗(HRP-抗兔IgG和抗小鼠IgG，1∶3000)，室溫孵育1h后, ECL底物化學發光顯色后曝光顯影。通過Scannerk708型BenQ掃描儀成像系統進行曝光分析。分別以APP/GAPDH、BACE/GAPDH、RAGE/GAPDH、LRP-1/GAPDH 的光密度值之比代表APP、BACE、RAGE、LRP-1的表達水平。

結果

1SHR和WKY大鼠海馬組織RAGE、LRP-1、APP和BACE mRNA的表達情況采用RT-PCR方法檢測結果提示,與WKY大鼠相比較，SHR海馬組織RAGE、BACEmRNA的表達水平明顯增高，差異具有統計學意義(P<0.05)。而APP mRNA表達水平相對降低(P>0.05)；LRP-1mRNA表達水平相對增高，但兩組間差異沒有統計學意義(P>0.05),見表1。

2SHR和WKY大鼠海馬組織RAGE、LRP-1、APP和BACE的表達情況采用Western blot方法檢測結果提示,與WKY大鼠相比較，SHR海馬組織RAGE、BACE的表達水平明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)。而APP和LRP-1表達水平相對增高，但兩組間差異沒有統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1　兩組大鼠海馬RAGE、LRP-1、APP和表達水平

注：與WKY比較，ΔP>0.05,*P<0.05

表2　兩組大鼠海馬組織的表達水平

注：與WKY比較，*P<0.05,ΔP>0.05

討論

Aβ是阿爾茨海默病老年斑的主要成分，其來源于淀粉樣前體蛋白(APP)的裂解。而BACE是APP裂解過程中產生Aβ的主要限速酶。在病理情況下，APP在BACE和γ-分泌酶的共同作用下，產生含有40～42氨基酸序列的少量Aβ42和大量Aβ40，其中Aβ40主要沉積于血管壁，而Aβ42是老年斑的主要成分之一。同時RAGE通過內吞和跨膜作用，不斷的攝取外周血液中的Aβ經血腦屏障轉進入腦內，而LRP-1則負責將腦間質液的Aβ經血腦屏障介導轉運出腦外，這樣Aβ在腦細胞間液的凈含量，不但取決于由APP經BACE裂解的生成量，也受RAGE 和LRP-1的經血腦屏障轉運平衡狀況的影響。在遺傳性家族性AD發病機制中，Aβ產生過多是其主要原因，但已有研究資料表明散發性AD發生的機制可能并不是Aβ的生成增多，而主要是由于Aβ經血腦屏障的轉運減少有關[2]。

血管病性危險因素是引起血管性癡呆的的主要因素。隨著人們對AD研究的不斷深入，流行病學調查發現高血壓等血管病性危險因素在AD發生發展中也起了一定的作用[3-4]，可以促進AD的發生或導致AD的臨床惡化。但對其發生機制尚不完全清楚，大多推測與血管因素造成腦血管損害而繼發腦的缺血性損害相關。我們研究發現和正常血壓WKY大鼠比較，SHR大鼠海馬組織APPmRNA表達不變，而BACEmRNA的表達增高，而后者表達增高有助于APP裂解生成Aβ。同時發現SHR大鼠海馬組織RAGEmRNA的表達也明顯增高，而LRP-1mRNA的表達變化不大，這樣可能導致Aβ經血腦屏障的轉運平衡發生了障礙，使得更多的Aβ轉運入腦，從而增加了腦細胞間液Aβ的凈含量。

進一步研究發現，SHR大鼠海馬組織BACE和RAGE的表達較血壓正常的WKY大鼠明顯增高；而APP 和LRP-1表達水平雖也增高，但無統計學意義。因此SHR確實存在Aβ代謝通路的異常改變，可能通過上調BACE的表達造成Aβ的生產增多和通過上調RAGE的表達造成Aβ轉運入腦增加，從而造成腦細胞間液Aβ凈含量異常增多，導致Aβ異常沉積，進而造成海馬膽堿能神經元的功能障礙，導致學習記憶功能的損害。已有研究發現AD患者和APP轉基因動物模型中，RAGE在血腦屏障的表達顯著上調，而LRP-1表達下調，且與Aβ的聚集有關[5]。血腦屏障上LRP-1 和RAGE 的表達異常，進而導致轉運Aβ功能失衡出現腦Aβ水平異常升高,繼而Aβ聚集和沉淀,形成老年斑[6]。

另外動物實驗研究表明大鼠結扎雙側頸總動脈造成腦缺血模型后β-分泌酶mRNA上調接近100 %。大鼠單側腦缺血模型后顯示結扎側大腦皮質的BACE1活性上調30 % , BACE1 蛋白量上調67 %[7]，提示腦缺血可誘發Aβ代謝紊亂，提示SHR大鼠也可能是通過高血壓造成腦缺血，而后由于腦缺血導致BACEmRNA表達上調，使得Aβ生成增多；同時由于RAGEmRNA的表達上調而導致Aβ經血腦屏障的轉運平衡發生了障礙，使Aβ更多轉運入腦，造成腦細胞間液Aβ凈含量明顯增多而沉積形成老年斑。

AD患者腦內RAGE表達上調，尤其在老年斑周圍神經元表面和微血管內皮細胞上表達尤為明顯。RAGE與Aβ結合后，跨血腦屏障轉運入腦，然后被小膠質細胞和神經元攝取誘導氧化應激反應，促進炎性因子釋放，并激活NF-κB系統，使炎性反應進一步加強，同時，RAGE和Aβ結合可促進內皮素表達增多，進而誘發缺血反應，二者均可造成神經細胞的調亡。最新的利用主動脈縮窄造成高血壓小鼠模型探討了高血壓認知損害和機制[8]，結果發現高血壓誘導了腦小血管Aβ和小鼠認知功能的降低，進一步研究發現這種改變與血管壁上RAGE的表達上調相關，而RAGE表達上調可能與氧化應激和糖基化產物形成有關。這和我們的結果相似。

另外在我們研究發現LRP-1在SHR海馬的表達和WKY上表達差異不大。但AD 患者和AD模型動物的血腦屏障上LRP-1表達顯著減少[9]。但也有證據表明AD模型動物腦微血管上LRP-1的表達與Aβ沉積呈負相關[10]。而另有研究發現在抗RAGE抗體IgG能阻斷Aβ對RAGE的影響，使處于豐富Aβ條件下腦微血管內皮細胞LRP-1的表達上調，說明在Aβ富集區域RAGE和LRP-1表達之間存在負相關[11]。因此腦內LRP-1的表達可能主要受腦局部微環境的影響，在疾病的不同階段可能表達水平存在差異。

因此,我們認為高血壓在AD的發生中具有一定的作用，其發生機制除了高血壓造成的腦缺血有關外，也可能與β淀粉樣蛋白代謝途徑異常有關。但Aβ代謝異常和高血壓及腦缺血之間的因果關系尚需要進一步研究。AD的發生除了被大家廣為接受的Aβ沉積級聯反應學說外，血管假說也是值得重視和研究，二者之間的關系密不可分，但之間的因果關系或協同作用仍不十分清楚。基于“神經血管單元”這一結構的解剖和生理理論體系，血管神經解耦聯學說可能更好的詮釋了血管因素和AD發病的內在聯系和機制[12]，而Aβ、RAGE和BACE三者之間的相互關系是研究血管因素在AD發生中的作用焦點之一，也是AD防治的一個值得關注的潛在靶點。

參考文獻

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(收稿:2015-12-04)

【中圖分類號】R363.2

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.06

The correlation research of abnormal expression of RAGE and BACE in Hippocampal and cognitive impairment in SHR

Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710061)

Qiao JinWang XinyangLu Wenhuiet al

ABSTRACTObjective: To explore the changes of β-amyloid proteins (Aβ)metabolic pathways in spontaneously hypertensive rats and reveal significance of Aβmetabolic abnormalities in cognitive impairment related to hypertension. Methods: SHR and WKY rats as the research object, using RT-PCR and Western blot method to detect mRNA and protein expression level of RAGE, LRP - 1, APP and BACE in SHR and WKY hippocampal. Results: Compared with WKY rats, the expression levels of RAGEmRNA and BACEmRNA in SHR hippocampal tissue increased significantly (P < 0.05), whILe the APP mRNA expression level relativly decrease (P > 0.05), LRP - 1 mRNA expression level was relatively higher (P> 0.05); Compared with WKY rats, the expression level of RAGE and BACE in SHR hippocampal tissue signIFIcantly increased (P< 0.05), whILe the APP and LRP - 1 expression level was relatively higher (P> 0.05). Conclusion：Abnormal expression of mRNA and protein of RAGE and BACE in hippocampus is associated with SHR cognitive impairment, it is to say that Aβ metabolic abnormalities may be involved in the mechanism of cognitive impairment due to high blood pressure.

KEY WORDSHypertension/physiopathologyCognition disordersAmyloid precursor proteinSecretasesReceptor for advanced glycation end productsLow-density lipid protein receptor-related protein-1Rats

*陜西省衛生和計劃生育委員會基金資助項目(2014D34)

△教育部環境與基因相關疾病研究室