尾巨桉3個無性系外植體誘導技術研究

石 前， 梁秀莉， 李飛宇， 鄧冬麗， 李麗芳， 李 俏*

(1.廣西壯族自治區國有東門林場，廣西扶綏 532108；2. 中種國際種子有限公司，北京 100028)

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尾巨桉3個無性系外植體誘導技術研究

石 前1， 梁秀莉1， 李飛宇2， 鄧冬麗1， 李麗芳1， 李 俏1*

(1.廣西壯族自治區國有東門林場，廣西扶綏 532108；2. 中種國際種子有限公司，北京 100028)

摘要[目的]研究尾巨桉3個無性系的外植體誘導相關技術。[方法]篩選最佳采集季節、最優取材部位、最佳消毒時間和最優植物生長調節劑(6-BA)濃度，提高尾巨桉無性系外植體的萌芽率。[結果] 3個無性系最佳誘導季節為春秋兩季；外植體誘導取材的最佳部位是半木質化的枝條；DH32-26、DH32-28外植體的最佳消毒時間為7 min、DH32-29外植體的最佳消毒時間為5 min；適宜外植體誘導的植物生長調節劑組合為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L，此時誘導萌芽率高。[結論]要提高外植體誘導的成功率，需從采集季節、取材部位、消毒時間以及植物生長調節劑組合方面綜合考慮，該研究為尾巨桉苗木快速繁殖提供了理論依據。

關鍵詞尾巨桉；無性系；外植體誘導

尾巨桉是尾葉桉和巨桉的雜交種，具有較強的抗病、抗蟲、抗風等能力，目前在造林中推廣應用較多的無性系是尾巨桉系列的優良無性系品種。當前已應用于造林的尾巨桉優良無性系主要有DH32-29、DH32-28、DH32-26、DH32-27、DH32-13等。在生產中尾巨桉無性系組培苗需求量增長迅速，促進了組培育苗技術的快速發展和日趨完善。然而組培育苗技術各環節中最核心的外植體誘導技術存在污染率高、萌芽率低、繁殖倍數低和馴化時間較長等問題，極大地影響了工廠化組培育苗生產的速度和質量，也增加了育苗成本。筆者對尾巨桉3個優良無性系進行外植體誘導技術研究，探索桉樹不同無性系在組培技術上的差異性，尋求最佳的技術途徑，提高誘導成功率和縮短誘導時間，有利于提高無性系組培育苗速度以及降低生產成本，同時也能完善補充尾巨桉的快繁技術，為尾巨桉苗木快速繁殖提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗地概況試驗地位于崇左市扶綏縣廣西國營東門林場林科所國家良種繁育中心苗圃，地理坐標為107°15′～108°00′E、22°17′～22°30′N，東西長80 km，南北寬20 km，屬于南亞熱帶地區，季風氣候明顯，年日照時數1 634～1 719 h，年平均氣溫22 ℃，極端最高溫40 ℃，極端最低溫-4 ℃, 年霜降3.1 d，位于十萬大山的雨影區，雨量偏少，年降雨量1 100～1 300 mm，相對濕度74%～83%。

1.2材料供試材料為東門林場優良無性系DH32-26、DH32-28、DH32-29。DH32-26、DH32-28取自東門林場雷卡分場13林班內，DH32-29取自華僑分場22林班內，試驗時間為2010～2013年。

1.33個無性系無菌培養繁殖體系的建立

1.3.1外植體采集。在同一無性系的林分內按優樹選擇的標準測樹高、胸徑，排除邊緣木和孤立木，選好優樹伐倒，待伐樁上萌發出枝條，經不斷對萌芽修剪和防蟲防菌的藥物處理，枝條達到半木質化時便可剪取伐樁上萌發的枝條，外植體采集選擇在連續5 d左右晴朗的天氣之后，不能在清晨取材，因為10：00之前露水未干，空氣濕度大，病菌易滋生，污染率增大，10：00之后經過陽光中的紫外線照射，減少了環境中真菌、細菌數量，以及外植體表面的病菌。外植體采集前要根據需要做好誘導前的準備工作，在伐樁上選取半木質化的芽條，剪去葉片只留葉柄后，立即放入裝有水的桶里，防止蒸騰作用對外植體的影響，將不同無性系分別做好標記并捆扎好，對伐樁上剩下的生長過旺的枝條要進行修剪，以便下一批枝條萌發和成長。

1.3.2外植體預處理。采集回外植體，用毛刷輕輕刷洗枝條表面，放入清水中沖洗30～60 min，再用飽和的洗衣粉溶液浸泡，不停振蕩，洗去枝條表面的灰塵，再反復用清水沖洗2～3遍，干凈后進入接種室進行下一步處理。在超凈臺上將枝條剪成2 cm左右帶1～2個腋芽的莖段，并裝入無菌瓶內，用75%乙醇浸泡約30 s，立即用無菌水沖洗3～5次，選用“二步消毒法”對枝條進行處理，先用1%氯化汞處理后，用無菌水沖洗3～5次，接著進行氯化汞第2次處理，再用無菌水沖洗3～5次；用干凈的濾紙吸干水分，剪去枝條被褐化的部分，插入培養基中。

1.3.3外植體誘導培養條件。接種后先用深色的布遮蓋，在全暗條件下培養15 d，待出芽后置散射光下培養30 d。

1.43個無性系外植體誘導的研究

1.4.13個無性系在不同季節外植體誘導的研究。于春(3～5月)、夏(6～8月)、秋(9～11月)、冬(12月～次年2月)4個季節，將經過消毒劑滅菌后的不同材料接種于誘導培養基中進行誘導，統計尾巨桉3個無性系誘導的萌芽率、褐化率、污染率。

1.4.23個無性系不同外植體部位誘導對比研究。選取3個無性系枝條的上段(幼嫩部分)、中段(半木質化部分)、下段(完全木質化部分)進行誘導，對比尾巨桉3個無性系誘導的萌芽率、褐化率、污染率。

1.4.3氯化汞不同消毒時間對3個無性系外植體誘導的影響。設置氯化汞不同消毒時間(3、5、7、10 min)，研究3個無性系枝條在不同消毒時間下外植體誘導變化，設3個重復，每重復10瓶，每瓶1支，共30枝，統計尾巨桉3個無性系誘導的萌芽率、褐化率、污染率。

1.4.4 6-BA不同濃度對3個無性系外植體萌芽率的影響。使用改良的MS培養基為基本培養基，NAA濃度為0.4 mg/L，分別添加3個濃度(1.3、1.0、0.7 mg/L)6-BA，設3個重復，每重復10瓶，每瓶1支，共30枝，對比尾巨桉3個無性系誘導的萌芽率。

2結果與分析

2.13個無性系在不同季節外植體誘導情況一般來說，采集外植體的時間比較關鍵，在不同季節誘導的結果不同。3～5月正是萬物復蘇、萌動的季節，伐樁上容易萌發出大量的枝條，15～20 d可取1次枝條，這時期的桉樹枝條已蓄積了充足的內源激素，所含的營養物質也較豐富，枝條的抗病性最強，因此3～5月是最適合做外植體誘導的季節。6～8月是汛期和旱期并存，高濕和高溫天氣交替，是病蟲活躍期，這時候采集枝條帶菌量大，誘導難度高。9～11月進入秋高氣爽的秋季，天氣比較干燥，也是誘導的好季節，由于一般選擇在6～8月砍樹伐樁，伐樁上萌芽量還比較少。12月～次年2月天氣寒冷，枝條萌動時間長，萌芽率不高。由表1可知，3個無性系在各季節的萌芽率和污染率稍有差異，但其表現是基本一致的，在春秋季誘導的萌芽率比較高，夏冬季誘導的萌芽率比較低。總體來說，DH32-29無性系在各季節誘導的萌芽率優于DH32-28和DH32-26。

表1　3個無性系在不同季節外植體誘導情況

2.23個無性系的不同部位外植體誘導情況外植體的生理年齡對誘導成功率有一定的影響，越靠近伐樁基部的枝條生理年齡越老，越遠離伐樁基部的枝條生理年齡越小。由表2可知，雖然3個無性系的不同部位誘導的結果稍有差別，但在不同部位有共同的規律，即選取半木質化部位誘導效果是最好的，此部位萌芽枝數多，污染率較低，褐化率也較低；而上段的枝條太嫩，腋芽容易被消毒劑殺死，褐化嚴重，又因其遠離樹樁，接觸到的微生物少，所以污染率比較低；下部枝條已完全木質化，腋芽不易萌發，萌芽率低，萌出的芽質量不好，枝條又靠近樹樁，容易感染微生物，誘導率低，褐化率也高。由于3種無性系的遺傳物質不同，其外植體誘導也稍有差別，DH32-29誘導可選取的枝條多，誘導的萌芽數較多，是一個比較容易誘導的無性系，DH32-26、DH32-28伐樁上的萌芽較少，誘導萌動率相對DH32-29較低，誘導比DH32-29難。

2.3氯化汞不同消毒時間對3個無性系外植體成活率的影響用于誘導的外植體所處的環境比較復雜，灰塵及許多微生物附著在其表面，使得外植體攜帶的菌落多，容易造成污染，所以外植體誘導時要對其進行表面滅菌處理，消毒時間的長短對誘導結果有不同的影響。

由表3可知，消毒時間對誘導的結果有影響，3 min的消毒時間較短，雖然枝條褐化輕，但枝條中的內生菌未被殺死，造成嚴重污染，影響了腋芽的萌發；5～7 min的消毒時間比較合適，此時污染輕，萌芽多；10 min的消毒時間太長，已殺死了腋芽芽點，使腋芽難以萌發。隨著消毒時間的加長，各無性系接種枝條褐化越來越嚴重。綜合分析可知，DH32-26和DH32-28外植體的最佳消毒時間是7 min，DH32-29外植體的最佳消毒時間是5 min。

表2　3個無性系的不同部位外植體誘導情況

表3　氯化汞不同消毒時間對3個無性系外植體成活率的影響

2.46-BA不同濃度對3個無性系外植體萌芽率的影響由表4可知，3個無性系在6-BA為1.0 mg/L時，誘導萌芽率最高，此時DH32-29外植體誘導萌芽率為80.0%、DH32-28為71.1%、DH32-26為68.9%。

表46-BA不同濃度對3個無性系外植體萌芽率的影響

Table 4Effects of different 6-BA concentrations on explant germination rate of three clones

無性系Clones6-BA濃度6-BAconcentration∥mg/L萌芽率Germinationrate∥%DH32-261.367.81.068.90.760.0DH32-281.370.01.071.10.762.2DH32-291.375.61.080.00.771.1

3結論與討論

該研究結果表明，春秋兩季是誘導尾巨桉外植體萌發的最佳取材季節，此時可供選擇萌芽條多，污染率少，誘導成功率高。對莖段取材部位的研究表明，半木質化的枝條誘導效果是最好的。由于各無性系生理特性不同，采集的地理環境不同，帶菌量也不同，用于外植體消毒的藥劑種類也不同，該試驗先用75%酒精處理外植體表面后，再用0.1%的氯化汞作為消毒劑，通過對4個不同時間的消毒處理進行研究，結果表明3個無性系中，DH32-29外植體用HgCl2消毒5 min可取得較高的萌芽率，DH32-26、DH32-28外植體用氯化汞消毒7 min可取得較高的萌芽率。采用3個濃度的6-BA處理各無性系外植體，結果表明適宜外植體誘導的植物生長調節劑組合為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L，誘導萌芽率最高。

在尾巨桉3個無性系的繼代培養中，培養材料由于繼代繁殖時間長、次數多，染色體變異可能性會增大，再生繁殖能力下降，因此要及時更換材料。植物種類不同，繼代次數對其影響也不同，植物能保持原有的再生能力代數也不同，如除蟲菊在5代后出現生長不佳的現象[1]，百合多次繼代繁殖出現變異現象[2]，黑木耳菌種隨著繼代次數的增加而逐漸退化[3]，桉樹隨著繼代次數的增加，樹高及地徑生長呈下降趨勢，抗病力減弱[4]。經檢測，桉樹在30代內DNA水平上未發生變異[5]，要根據桉樹這一特點，及時重新誘導，獲得新的植株，以保持繁殖材料的活力。

污染是尾巨桉無性系組織培養中一個難題，培養物受到污染，則不能正常生長，既浪費了材料和時間，又增加了成本，因此要提高外植體誘導的成功率，必須把控制污染放在第1位[6]。取材時要考慮是否在合適的季節和天氣、植物材料的部位、選取消毒劑種類和濃度、消毒時間、接種操作過程等因素，從而減少外植體污染的可能性，取得誘導成功。

參考文獻

[1] 齊靜靜，毛靜，胡昊，等.繼代次數對除蟲菊生長及其除蟲菊酯質量分數的影響[J].云南農業大學學報(自然科學版)，2014(2):216-222.

[2] 蒲秀琴，王艦，薛寒青.不同繼代次數對東方百合組培苗分化的影響[J].青海農林科技，2008(1):55-56.

[3] 李曉，孟秀秀，李壽健，等.黑木耳母種繼代培養次數與菌種退化關系研究[J].黑龍江農業科學,2015(4):138-139.

[4] 譚健明，蔡玲，王以紅，等.不同無性繁殖復壯措施對桉樹生長及抗病性比較研究[J].廣西科學，2007(2):167-171.

[5] 覃子海，藍肖，吳幼媚，等.利用ISSR檢測桉樹組培苗遺傳穩定性的研究[J].熱帶農業科學，2013(4):26-29.

[6] 歐陽磊.桉樹組培快繁中存在的問題與對策[J].福建林業科技，2006，33(1)：203-206.

作者簡介石前(1982- )，女，湖南衡陽人，工程師，碩士，從事林木良種繁育研究。*通訊作者，從事桉樹遺傳改良和無性系開發工作。

收稿日期2016-04-03

中圖分類號S 723.1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)15-164-03

Study on Explant Induction of Different Hybrids ofEucalyptusurophylla×E.grandisClones

SHI Qian1, LIANG Xiu-li1, LI Fei-yu2, LI Qiao1*et al

(1. Guangxi Zhuang Autonomous Region Dongmen Forest Farm, Fusui, Guangxi 532108; 2. China Seed International Seed Co. Ltd., Beijing 100028)

Abstract[Objective] The aim was to study explant induction relevant technology of Eucalyptus urophylla × E. grandis three clones. [Method] The optimal collection season, sampling part, disinfection time and concentration of plant growth regulator(6-BA) was selected, so as to improve germination rate of explants of Eucalyptus urophylla × E. grandis clones. [Result] The spring and autumn were the optimal seasons for the explant induction, semi-lignified branches was the most suitable part of explant sampling, the most appropriate disinfection duration with mercuric chloride is 7 minutes for DH32-26 and DH32-28, and 5 minutes for DH32-29. 6-BA1.0 mg/L and NAA0.4 mg/L as plant growth regulator combination was good for explant induction which with the best germination rate. [Conclusion] In order to improve the successful rate of explant induction, a comprehensive consideration should be made in terms of the collection season, sampling part, disinfection time and plant growth regulator combination. The study can provide theoretical basis for rapid propagation of Eucalyptus urophylla × E. grandis seedlings.

Key wordsEucalyptus urophylla × E. grandis; Clone; Explant induction