補充水解膠原蛋白與跑臺運動聯合作用對生長期大鼠骨密度和組織形態計量學指標的影響

馬濤+蘇紅燕

摘要：目的：從補充水解膠原蛋白（hydrolyzed collagen，HC）和跑臺運動兩個方面探索促進生長期骨生長的有效途徑。方法：4周齡雄性SD大鼠48只，隨機分為6組，每組8只：正常對照組（CON）、6%HC補充組（HC6）、12%HC補充組（HC12）、跑臺運動組（CON+Ex）、6%HC補充+跑臺運動組（HC6+Ex）和12%HC補充+跑臺運動組（HC12+Ex）。跑臺訓練速度為30 m/min，每次訓練60 min，每周訓練6 d，共訓練8 w。8w后測試各組大鼠股骨骨密度（bone mineral density，BMD）和形態學指標以及脛骨松質骨組織形態計量學指標。結果：與其相應的對照組相比，補充HC組與運動組大鼠股骨BMD和形態學指標，以及脛骨松質骨組織形態計量學指標均顯著增加；高劑量補充HC組與中等劑量補充HC組相比，其上述指標差異無統計學意義；補充HC與跑臺訓練聯合干預組與單純補充HC組或單純跑臺訓練組相比，上述指標均顯著增加。結論：補充HC與跑臺運動均能有效促進生長期的骨生長；中等劑量的HC補充即能較好地促進生長期的骨生長，而高劑量的補充并不能起到更好效果；補充HC與跑臺運動具有協同作用，其效果優于單純補充HC或單純跑臺運動。

關鍵詞：水解膠原蛋白；跑臺運動；骨密度；組織形態計量學

中圖分類號：G804.4 文獻標識碼：A 文章編號：1006-2076（2016）04-0077-08

Abstract：Objective：This study aimed to explore effective ways to promote growth of growing bone from supplement hydrolyzed collagen and treadmill exercise. Methods：Forty-eight male SD rats， 4 weeks of age， were randomly divided into six groups and assigned as follows： normal control group （CON）， 6%HC supplemented group （HC6）， 12%HC supplemented group （HC12）， treadmill exercise group （CON+Ex）， 6%HC + supplement treadmill exercise group （HC6+Ex）and 12%HC + supplement treadmill exercise group （HC12+Ex）， each group of eight rats. Rats treadmill trained speed is 30m/min， eight weeks of training， training six days a week， 60 minutes a day of

training.After eight weeks， bone mineral density and morphological indicators of femur and histomorphometry indexes of tibia cancellous bone in each group were tested.Results：Compared with the corresponding control groups， bone mineral density and morphological indicators of femur and histomorphometry indexes of tibia cancellous bone in supplemented HC group and the exercise group were significantly increased. Compared with moderate-dose HC supplements group， the difference of these indexes in high-dose HC supplement group were not statistically significant. Compared with simply HC supplement group and simply treadmill training group， these indexes in combined HC supplement with treadmill training group were significantly increased.Conclusion：Supplementary HC and treadmill exercise both can effectively promote growth of growing bone. Moderate doses of HC supplement can better promote growth of growing bone， high-dose supplementation did not play better results. HC supplement with treadmill exercise have a synergistic effect， the effect is better than simply HC supplements and simply treadmill exercise.

Key words： hydrolyzed collagen； treadmill exercise； bone mineral density； histomorphometry

生長發育期是骨量增長的一個關鍵時期，此期間骨量的快速獲得，是與骨骼本身處于突增生長階段相吻合的。人生的最初20年里所獲得的骨量可以達到其峰值骨量（PBM，Peak bone mass）的90%～99%，峰值骨量是維持成人生命的“骨庫”，因而青少年時期骨量的獲得對其成年后骨骼的健康起著決定性的作用[1]。峰值骨量的水平與成年后患骨質疏松癥的可能性密切相關[2]。因此，在生長期獲得盡可能高的基礎骨量，對提高骨量峰值以及保證成年后的骨健康具有重要的意義。

業已證明，在生長期，適宜的機械負荷刺激（如體力勞動或體育運動）對于提高峰值骨量具有重要作用[3]。除此之外，營養因素（如蛋白質的攝入）也是影響骨形成的重要因素之一[4]。因此，為了能夠提高峰值骨量，在生長期要經常參加體育活動以使骨組織經常受到機械負荷刺激，而且通過營養補充攝取足夠的蛋白質也是必不可少的。就青少年運動員來說，他們在經歷高水平的體育鍛煉的同時，雖也攝取了足夠的蛋白質[5]，然而體育鍛煉和蛋白質攝入對于其骨組織生長的影響并沒有得到充分的研究。已有研究顯示，補充水解膠原蛋白（hydrolyzed collagen，HC）可以有效減緩隨年齡增長而增加的骨質流失，然而，關于補充HC與運動聯合作用對生長期骨量影響的研究還未見報道。本研究通過對補充HC與跑臺運動聯合作用對生長期大鼠BMD和組織形態計量學指標影響的研究，旨在從營養和運動兩個方面探索促進生長期骨生長的有效途徑，為提高青少年峰值骨量和保證成年后的骨健康提供有效方法和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

4周齡雄性SD大鼠48只，體重（89.26±6.32）g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[許可證號為SCXK（滬）2003-0002]。在標準的實驗室環境下分籠飼養，環境溫度為（22±1）℃，光照遵循12 h：12 h明暗周期。動物購回適應本實驗室環境和飲食1周后，被隨機分為6組，每組8只：正常對照組（CON）、6%HC補充組（HC6）、12%HC補充組（HC12）、跑臺運動組（CON+Ex）、6%HC補充+跑臺運動組（HC6+Ex）和12%HC補充+跑臺運動組（HC12+Ex）。大鼠分籠飼養，各組大鼠每日提供足夠食物，自由飲水，每周記錄大鼠體重和進食量。

1.2 HC補充方案

HC的補充是通過動物食物配方的改變實現的，各組大鼠食物的蛋白含量如下：CON組和CON+Ex組大鼠食物均為標準嚙齒類動物飼料，其中蛋白總含量為20%，蛋白中不含HC蛋白；HC6組和HC6+Ex組大鼠為中等劑量HC補充組，其食物蛋白含量為：HC蛋白含量為6%，蛋白總含量為20%；HC12組和HC12+Ex組大鼠為高劑量HC補充組，其食物蛋白含量為：HC蛋白含量為12%，蛋白總含量為20%。

1.3 跑臺訓練方案

CON+Ex組、HC6+Ex組和HC12+Ex組大鼠每周跑臺訓練6 d，共訓練8 w。跑速從首次訓練的10 m/min以每日5 m/min的速度逐漸遞增為30 m/min，每日訓練時間從首次訓練的35 min開始，以每日5 min的速度逐漸遞增為60 min。從第二周開始，大鼠每日訓練時間固定為60 min，跑速固定為30 m/min。

1.4 取材

于跑臺訓練組大鼠最后一次訓練結束24小時后，稱量大鼠體重，斷頸椎處死所有大鼠。分離大鼠左側股骨和脛骨，用鑷子和紗布除去骨表面的軟組織，用游標卡尺測量股骨的形態學指標后，將股骨用浸透生理鹽水的紗布包好，放于-20 ℃ 冰箱內保存待測BMD，將脛骨投于10%甲醛溶液中進行固定，待測組織形態計量學指標。

1.5 測試方法

1.5.1 體重及進食量的測定

飼養期間每周固定時間用YP601N電子分析天平測試各小鼠體重并記錄，最后一次體重測試在小鼠處死前一天晚上進行；每周用YP601N電子分析天平稱量各籠大鼠飼料添加量和剩余量并記錄。

1.5.2 游標卡尺測量股骨的形態學指標

分離大鼠左側股骨和脛骨后，用游標卡尺（精確度為0.02 mm）測量股骨的長度、近端厚度（矢狀徑）和寬度（額狀徑）、遠端厚度（矢狀徑）和寬度（額狀徑）、中段厚度（矢狀徑）和寬度（額狀徑）。

1.5.3 Kodak 雙能X 射線骨密度儀測量股骨干骺端BMD

從- 20℃冰箱中取出左側股骨，室溫自然解凍，用Kodak 雙能X 射線骨密度儀和Carestream 骨密度分析軟件測量股骨遠端干骺端BMD（圖1）。

1.5.4 脛骨組織形態計量學指標的測定

所有大鼠分別于處死前第10天和第3天腹腔注射鹽酸四環素（購于上海生工生物工程技術服務有限公司）。處死后，取左側脛骨經10%甲醛溶液固定2天，流水沖洗2小時，酒精梯度脫水（75%、85%、95%、100%各2天），甲基丙烯酸甲酯（MMA）包埋，室溫干燥后在德國LEICA SP1600切片機上進行50 μm切片，一部分在熒光顯微鏡（日本Olympus IX71）下直接觀察熒光標記并拍片，觀察位置在距骺線1～4 mm 范圍；另一部分經磨成5 μm的薄片后，HE染色，在日本產Olympus IX71顯微鏡下觀察并拍片，觀察位置在距骺線1～4 mm范圍。測量參數如下：

骨小梁體積（TBV，trabecular volume），指骨小梁體積占松質骨總體積的百分比。骨小梁寬度（Tb. Wi，trabecular width），單位為μm。骨小梁數目（Tb. N，trabecular number），單位為個/mm。皮質骨礦化沉積率（MAR，mineral apposition rate），熒光雙標記帶間的距離除以二次標記相隔的天數，單位為μm/d。

1.6 統計處理

各檢測結果以[AKX-]±S表示，用SPSS12.0軟件進行統計分析。首先，使用多因素方差分析（MANOVA）對數據進行統計學檢驗，如果發現有顯著性差異，運動組和非運動組之間、不同劑量HC補充組之間采用單因素方差分析（ANOVA）進行檢驗，實驗前及8周實驗后數據檢驗采用配對T檢驗（Paired T test）。以P<0.05為差異顯著性標準，以P<0.01為差異非常顯著性標準。

2 結果

2.1 各組大鼠的進食量

由圖2可知，隨著大鼠的生長，其進食量也有一定的增加，而各組大鼠進食量的差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 各組大鼠實驗前后體重變化

實驗前各組大鼠體重差異無統計學意義（P>0.05）；實驗后各組大鼠體重均比實驗前有較大幅度的增長（P<0.01）；實驗后補充HC組與其對應的正常飼養組相比（即HC6、HC12與CON相比，或者HC6+Ex、HC12+Ex與CON+Ex相比），大鼠體重顯著增加（P<0.05或P<0.01）；而高劑量補充HC組與中等劑量補充HC組相比（即HC12與HC6相比，或HC12+Ex 與HC6+Ex相比），其體重差異無統計學意義（P>0.05）；而運動各組（CON+Ex、HC6+Ex、HC12+Ex）大鼠體重與其對應的非運動組（CON、HC6、HC12）大鼠相比，體重均顯著下降（P<0.01）（見圖3）。

2.3 各組大鼠股骨形態學指標比較

由表1和表2可知：補充HC組與其對應的正常飼養組相比（即HC6、HC12與CON相比，或者HC6+Ex、HC12+Ex與CON+Ex相比），大鼠股骨形態各項指標均顯著增加（P<0.05或P<0.01）；而高劑量補充HC組與中等劑量補充膠原蛋白組相比（即HC12與HC6相比，或者HC12+Ex與HC6+Ex相比），其股骨形態學各項指標差異無統計學意義（P>0.05）；運動各組（CON+Ex、HC6+Ex、HC12+Ex）與其對應的非運動組（CON、HC6、HC12）相比，大鼠股骨形態學各指標均顯著增加（P<0.01或P<0.01）；而補充HC與跑臺訓練聯合干預組（HC6+Ex或HC12+Ex）與單純補充HC組（HC6或HC12）或單純跑臺訓練組（CON+Ex）相比，大鼠股骨形態學各指標均顯著增加（P<0.05或P<0.01）。

2.4 各組大鼠股骨干骺端BMD比較

由圖4可知：補充HC組與其對應的正常飼養組相比（即HC6、HC12與CON相比，或者HC6+Ex、HC12+Ex與CON+Ex相比），大鼠股骨干骺端BMD均顯著增加（P<0.05或P<0.01）；而高劑量補充HC組與中等劑量補充HC組相比（即HC12與HC6相比，或者HC12+Ex與HC6+Ex相比），其股骨干骺端BMD差異無統計學意義（P>0.05）；運動各組（CON+Ex、HC6+Ex、HC12+Ex）與其對應的非運動組（CON、HC6、HC12）相比，大鼠股骨干骺端BMD均顯著增加（P<0.01）；而補充HC與跑臺訓練聯合干預組（HC6+Ex或HC12+Ex）與單純補充HC組（HC6或HC12）或單純跑臺訓練組（CON+Ex）相比，大鼠股骨形態學各指標均顯著增加（P<0.05或P<0.01）。

2.5 各組大鼠脛骨干骺端骨組織形態計量學指標比較

圖5和圖6分別是大鼠脛骨干骺端松質骨骨小梁HE染色圖片及皮質骨熒光雙標記圖片。統計結果顯示：補充HC組與其對應的正常飼養組相比（即HC6、HC12與CON相比，或者HC6+Ex、HC12+Ex與CON+Ex相比），大鼠脛骨干骺端組織形態計量學指標均顯著增加（P<0.05或P<0.01）；而高劑量補充HC組與中等劑量補充HC組相比（即HC12與HC6相比，或者HC12+Ex與HC6+Ex相比），其脛骨干骺端組織形態計量學指標差異無統計學意義（P>0.05）；運動各組（CON+Ex、HC6+Ex、HC12+Ex）與其對應的非運動組（CON、HC6、HC12）相比，大鼠脛骨干骺端組織形態計量學指標均顯著增加（P<0.01）；而補充HC與跑臺訓練聯合干預組（HC6+Ex或HC12+Ex）與單純補充HC組（HC6或HC12）或單純跑臺訓練組（CON+Ex）相比，大鼠脛骨干骺端組織形態計量學指標均顯著增加（P<0.05或P<0.01）（見圖7）。3 分析與討論

3.1 跑臺運動與生長期骨生長

骨組織是一種代謝非常活躍的組織，其外部形態和內部結構都與其自身所處的力學環境密切相關。美國骨生理學家Harold Frost[6]的研究和論斷被人們稱為機械應力調控骨重建的最經典理論。Harold Frost認為，機械力因素（如骨骼肌施加在骨組織上的力以及體力活動對骨組織的機械應力等）對骨組織的生理過程起著決定性作用，骨組織所受機械負荷的變化影響著骨代謝激素的反應，從而對骨鈣含量進行調節。運動可以看做是對骨組織的一種機械刺激，這種機械刺激同樣可以調節骨代謝，優化骨結構。在本實驗室的前期研究中[7-9]，發現運動可顯著提高生長期大鼠和骨質疏松模型大鼠BMD并優化其松質骨骨小梁結構。國外的大量研究也表明[10]，體力活動或體育運動可顯著提高生長期青少年兒童骨組織的生長發育，使BMD和骨強度均顯著增加。在本研究中，運動方式采用的是動物跑臺運動，根據Wheeler DL等人報道[11]，30 m/min的跑速相當于大鼠60%～70% VO2max的運動強度。考慮到過大的運動強度可能會對骨代謝產生不利的影響，反而會影響大鼠骨組織的生長[12]，故本研究也采取了30 m/min的速度作為大鼠的跑速。此外，在本研究中，大鼠的跑臺訓練周期選擇為8周，這是根據大鼠的壽命周期長度安排的，由文獻[13]可知，SD大鼠的壽命為2～3年，而8周約占大鼠整個生命周期的6%～7%，相當于人類生命周期中的4～5年（按照平均壽命75歲計算）。由此可見，對于SD大鼠來說，8周的跑臺訓練應屬于較長時間的系統的訓練。

BMD是指單位體積內的骨礦含量，是影響骨組織力學性能的一個重要指標，目前國內外均把BMD作為評價骨強度的一個最方便、最常用的臨床指標[14]。本研究結果顯示，跑臺運動可顯著提高生長期大鼠股骨BMD，和本實驗室前期研究結果[7-8]一致。近年來的研究表明[15]，盡管骨組織的力學性能80%由BMD決定，但是骨組織的力學性能還與其內部結構密切有關，尤其對于對松質骨而言，骨小梁三維構筑方式以及骨小梁間的連接性與骨強度密切相關。骨小梁體積（TBV）反映的是單位體積內骨小梁所占的體積百分比，即骨小梁的疏密程度，它同骨小梁寬度（Tb.Wi）和骨小梁數目（Tb.N）共同反映了松質骨中骨小梁的三維結構。本研究結果顯示，跑臺運動組大鼠股骨長度、寬度和厚度指標均顯著增加，脛骨組織形態計量學指標TBV、Tb.Wi和Tb.N均顯著增加，表明跑臺運動可促進皮質骨的生長和松質骨骨小梁的三維結構重建，使骨組織更致密，從而增加骨組織的生物力學強度。四環素是一種活性熒光物質，進入血液循環與無機鹽結合沉積于骨組織礦化前沿，在熒光顯微鏡下，可見到首次標記線埋于近小梁表面的骨基質中；第二條標記線更靠近骨表面。皮質骨礦化沉積率（MAR）是熒光雙標記帶間的距離除以兩次熒光標記相隔的天數，單位為μm/d，它是反映骨生長速率的指標，它代表成骨細胞礦化類骨質的速度[16]。本研究結果顯示，跑臺運動組大鼠MAR顯著大于非跑臺運動組大鼠，說明跑臺運動可以增加成骨細胞的活性，提高其類骨質分泌與礦化的速度，促進骨的生長。

3.2 補充HC與生長期骨生長

Ⅰ型膠原蛋白是一種主要的結構蛋白，更是骨組織進行鈣化的主要的細胞外基質蛋白，它廣泛分布于人類機體的各種組織，大約占身體蛋白總量的25%，在人類結締組織中Ⅰ型膠原蛋白的比例更是達到了80%[17]。研究證明，Ⅰ型膠原蛋白的合成對于進一步促進成骨細胞的分化至關重要[18-19]。業已證明，動物服用HC可以有效提高BMD和骨礦含量（bone mineral content，BMC）[20]，服用HC也能夠顯著增加去卵巢大鼠骨基質中Ⅰ型膠原蛋白的含量[21]。而且，骨質疏松患者在注射降鈣素的同時口服HC能夠比單純注射降鈣素具有更強的對抗骨質流失的作用[22]。Guillerminet 等人的研究表明[23]，食用含HC蛋白的食物比食用標準的AIN-93N 食物能夠有效提高去卵巢小鼠的BMD。Mizoguchi 等人發現[24]，攝取含HC蛋白的食物在顯著增加去卵巢大鼠股骨BMD和骨強度的同時，能夠顯著提高血清骨鈣素（成骨作用標志物），說明補充HC能夠促進成骨細胞的成骨作用。而且血清羥脯氨酸和甘氨酸水平增加，說明補充HC可顯著提高血清氨基酸水平，這對合成骨組織蛋白十分重要。此外，體外實驗表明[25]，在成骨細胞培養體系中，HC能夠顯著提高堿性磷酸酶（成骨作用標志酶）的活性。這些研究結果表明，口服膠原蛋白肽能夠有效阻止增齡性骨質流失，然而，至今仍然沒有研究證明口服膠原蛋白肽是否也能夠增加生長期的骨形成作用。本研究的結果顯示，補充HC能夠增加生長期大鼠的BMD，提高其骨組織形態計量學指標，使骨組織更致密，促進生長期的骨生長。

在本研究中，為了研究動物HC攝入水平對于生長期骨生長的影響，動物HC的補充分為中等劑量組和高劑量組，此劑量的標準源于參考Reeves PG等人的研究，在Reeves PG等人的研究中[25]推薦，生長期大鼠食物中適宜的蛋白質含量應為17.9%，同時參考Wu J[20]等人和Nomura Y[21]等人研究中關于大鼠服用HC的劑量，將HC6組和HC6+Ex組大鼠食物（HC蛋白含量為6%，蛋白總含量為20%）作為中等劑量的HC補充，將HC12組和HC12+Ex組大鼠食物（HC蛋白含量為12%，蛋白總含量為20%）作為高劑量的HC補充。值得注意的是，在本研究中，高劑量HC補充組并沒有比中等劑量HC補充組獲得更高的BMD或骨組織形態計量學指標。這說明對于生長期的骨生長而言，中等劑量的HC補充即能起到較好的效果，而高劑量的補充并不能更好地促進骨組織的生長。已有一些關于蛋白質攝入水平對骨量影響的研究，如蛋白質缺乏可引起胰島素樣生長因子1的分泌減少，從而能夠阻止正常的骨量合成[27]。Takeda等人的研究表明，在生長期蛋白質攝入不足可減少骨量的獲得并且使骨強度下降[28]。然而，過高的蛋白攝入可導致尿鈣分泌的增加，同樣也可因此導致骨吸收作用的增加[29]，在生長期攝入過高的蛋白質也可以抑制跑臺訓練引起的骨量的獲得和骨強度的增加[28]。然而，Takeda等人的研究是以酪蛋白作為蛋白質補充物質，而對于高水平攝入HC同時結合跑臺訓練對于生長期骨量獲得的影響仍屬未知，所以本研究的目的在于研究是否高水平的HC補充比中等水平的HC補充能夠更加有效提高生長期大鼠的骨量。

3.3 補充HC與跑臺運動聯合作用與生長期骨生長

已有多數關于營養補充和運動聯合作用對BMD和骨結構影響的研究，如李爽等[30]研究了運動與中藥聯合作用對骨質疏松大鼠BMD的影響，結果顯示運動與中藥聯合作用較單純運動或中藥治療有較好的治療效果，同時減少副作用。再如章曉霜等[31]研究了不同強度運動和雌激素聯合作用對去卵巢大鼠骨骼生物力學性能的影響，結果顯示單純運動對力直接作用部位的力學性能—股骨頸最大載荷的影響大于單純補充雌激素，運動和雌激素無明顯協同作用；對于非力直接作用部位的力學性能—第2 腰椎最大凹入載荷及第3 腰椎最大壓縮載荷，運動和雌激素聯合有一定的協同作用。然而上述研究均是對去卵巢模擬婦女絕經后骨質疏松模型大鼠進行的研究，而關于營養補充和運動聯合作用對生長期大鼠BMD和骨結構影響的研究還未見報道，而且也未見有關HC補充與運動聯合作用對骨生長或骨代謝影響的報道。本研究的結果顯示：不論股骨BMD和形態學指標還是脛骨組織形態計量學指標，補充HC與跑臺運動聯合作用均比單純補充HC和單純跑臺運動能夠更大幅度地促進生長期的骨生長。這提示我們，補充HC和跑臺運動在促進生長期骨生長方面具有協同效應，二者分別從營養攝入和改變骨組織的應力環境方面促進成骨細胞的成骨活性，從而提高新骨組織的生成。

4 結論

4.1 補充HC與跑臺運動均能有效提高生長期BMD，使骨組織形態計量學指標增加，促進生長期的骨生長。

4.2 對于促進生長期骨生長而言，補充HC與跑臺運動具有協同作用，其效果優于單純補充HC或單純跑臺運動。

4.3 中等劑量的HC補充即能較好地促進生長期的骨生長，而高劑量的補充并不能起到更好效果。

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