子宮內膜異位癥中Livin和Smac的表達及相關性研究

祝　平，沈樹娜

(內蒙古包鋼醫院婦產科，內蒙古 包頭 014010)

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子宮內膜異位癥中Livin和Smac的表達及相關性研究

祝平，沈樹娜

(內蒙古包鋼醫院婦產科，內蒙古 包頭 014010)

[摘要]目的探討凋亡抑制蛋白家族的新成員Livin、第2個線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑Smac在子宮內膜異位癥(EMs)中的表達及二者與月經周期、EMs臨床分期的關系和相關性分析。方法選取2010年10月至2012年4月在內蒙古醫學院第三附屬醫院婦產科病房因EMs接受腹腔鏡手術或開腹手術，并且具有術后病理確診的EMs患者共60例作為研究組，收集子宮內膜異位癥病患的在位內膜、異位內膜組織各30例(增生期各16例，分泌期各14例)，對照組為30例正常內膜組織。采用免疫組化SP法檢測出各組標本中Livin、Smac蛋白的表達，并對結果進行統計分析。結果EMs在位、異位內膜組織中Livin的表達強度較對照組顯著升高，差異有統計學意義(χ2=12.510，P<0.05)；EMs在位、異位內膜組織中Smac的表達強度均低于正常子宮內膜的表達，差異有統計學意義(χ2=19.530，P<0.05)。在EMs在位內膜和異位內膜組織中，Livin和Smac的表達均與臨床分期無關(χ2值分別為0.741、0.002，均P>0.05)；在EMs在位內膜和異位內膜組織中，Livin和Smac的表達呈負相關(rs值分別為-0.933、-0.867，均P<0.05)。結論Livin高表達以及Smac低表達使異位內膜細胞增生及抗凋亡能力加強，導致了EMs的發生及發展。

[關鍵詞]子宮內膜異位癥，凋亡抑制蛋白，胱氨酸蛋白酶激活劑，免疫組織化學

子宮內膜異位癥(簡稱內異癥，Endometriosis，Ems)指具有生長功能的子宮內膜組織出現在子宮腔被覆內膜及宮體肌層以外的其他部位，卵巢受累最多，其嚴重危害女性的健康[1]。凋亡抑制蛋白家族(IAPs)的新成員Livin可通過多種途徑來發揮抗細胞凋亡的作用[2]；而第2個線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑(second mitochondrial activator of caspase，Smac)可通過阻止IAPs的作用發揮促凋亡作用[3]。本研究對Livin、Smac在EMs中的表達及各因子與月經周期、EMs臨床分期的關系進行相關性分析，探討兩者與EMs發生發展的關系，為EMs的臨床診斷、治療及預后評價提供新的理論依據。

1資料與方法

1.1研究對象

選取2010年10月至2012年4月在內蒙古醫學院第三附屬醫院婦產科病房因EMs接受腹腔鏡手術或開腹手術，并且具有術后病理確診的EMs患者60例作為研究組，其中異位內膜組織和在位內膜組織各30例(增生期各16例，分泌期各14例)。研究組中分為EMs異位組和在位組，EMs異位組：年齡21～52歲，按照美國生育協會(American Fertility Society，R-AFS)1985年臨床分期標準，Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期16例；EMs在位組：EMs患者通過診斷性刮宮或者子宮切除后得到的在位內膜，子宮內膜的分期是根據各期內膜形態學的特點，同時結合月經史做出判斷。隨機選取同期因子宮頸病變行子宮切除術患者的子宮內膜，同時未合并子宮腺肌病及EMs行子宮切除手術，術后病理證實為正常子宮內膜的30例患者作為對照組。

所有入選對象具有完整的臨床病理資料，術前6個月均未服用過類固醇激素、未放置宮內節育器，子宮內膜無病理改變，月經周期規律，無內分泌疾病史。

1.2實驗方法

采用免疫組化SP法進行檢驗，計數各個視野中陽性細胞的平均百分率，作為該張切片陽性細胞的百分率，然后打分：陽性細胞的百分率>75%為4分，51%～75%為3分，26%～50%為2分，5%～25%為1分，<5%為0分；陽性強度以多數細胞的呈色反應為準：深棕黃色為3分；棕黃色為2分；淡棕黃色為1分；無著色或著色很弱為0分。綜合分析判斷結果以兩者乘積>3分為陽性標準。

1.3統計學方法

應用Excel 2000建立數據庫，采用SPSS 16.0軟件包統計分析數據。計數資料兩組間比較采用χ2檢驗，相關性檢驗采用Spearman等級相關分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1凋亡抑制蛋白Livin基因的表達

Livin表達主要在子宮內膜上皮細胞的胞漿內，內膜血管幾乎無表達，見圖1。

圖1　Livin在Ems在位子宮內膜表達(100×)

Livin在對照組、在位組和異位組中的陽性表達差異有統計學意義(χ2=12.510，P<0.05)。在EMs異位內膜、在位內膜中Livin陽性表達均顯著高于正常對照組(χ2值分別為11.280、6.690，均P<0.05)；Livin在EMs在位、異位內膜中的陽性表達差異無統計學意義(χ2=0.693，P>0.05)，見表1。無論是EMs研究組還是對照組，Livin的陽性表達在月經的增生期與分泌期差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表2。

2.2第2個線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑Smac基因的表達

Smac主要表達在子宮內膜腺體細胞的胞漿內，內膜血管幾乎無表達，見圖2。

圖2Smac在Ems在位子宮內膜表達(100×)

Fig.2 Smac in eutopic endometrium

Smac在對照組、在位組和異位組中的陽性表達差異有統計學意義(χ2=19.530，P<0.05)。在EMs異位內膜、在位內膜中Smac陽性表達均顯著低于正常對照組(χ2值分別為19.461、5.554，均P<0.05)；Smac在EMs在位、異位內膜中的陽性表達差異有統計學意義(χ2=5.079，P<0.05)，見表1。Smac在EMs在位、異位內膜中的陽性表達在月經的增生期與分泌期差異均無統計學意義(均P>0.05)，而在正常子宮內膜中月經分泌期的陽性表達高于增生期，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1Livin和Smac在各組中的表達比較

Table 1 Comparison of Livin and Smac expressions among different groups

表2　　Livin和Smac在各組中增生期和分泌期的表達比較

2.3凋亡抑制蛋白Livin基因和第2個線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑Smac基因的表達與子宮內膜異位癥臨床分期的關系

EMs在位內膜中，Livin在Ⅰ～Ⅱ期的表達與在Ⅲ～Ⅳ期之間的表達差異無統計學意義(χ2=0.741，P>0.05)；Smac在Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期之間的表達差異無統計學意義(χ2=0.002，P>0.05)，見表3。

表3 Livin和Smac的表達與EMs臨床分期關系的比較

Table 3 Correlation of Livin and Smac expressions with

clinical staging of EMs

2.4凋亡抑制蛋白Livin基因和第2個線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑Smac基因在子宮內膜異位癥中的相關性

應用Spearman相關分析得出：在EMs在位內膜和異位內膜組織中，Livin與Smac呈負相關，rs值分別為-0.933、-0.867，均P<0.05。

3討論

3.1凋亡抑制蛋白Livin基因與子宮內膜異位癥的關系

IAPs家族的新成員Livin于2000年被發現[4]，其于人類第20號染色體q13.3上，包含7個外顯子及6個內含子，全長約4.6kb。Livin蛋白的羧基末端包含1個RING環指結構，由1個組氨酸(Histidine，His)和7個半胱氨酸(Cysteine，Cys)結合了2個鋅離子組成；N端包含1個BIR結構域，是一種新型鋅指結構，其中含有70個高度保守的氨基酸，BIR結構域可能是Livin基因抗凋亡部位。近年來研究發現子宮內膜中存在凋亡，其周期性的細胞增生及脫落是通過細胞凋亡和增殖失衡來實現的，這種周期性改變被促凋亡基因的水平調控[5]。有研究表明Livin可通過以下3種途徑抑制細胞凋亡[6-7]：①Livin可抑制半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶(Cysteine-containing，aspartate-specificpr-oteases，Caspase)-3的活性，同時與未激活的Caspase-9、激活的Caspase-9及Caspase-9前體蛋白相結合，阻斷它們依次切割激活，并阻斷Caspase-3對Caspase-9前體的正反饋激活，從而產生抗凋亡作用；②Livin可與TAB1(TAK1 binding protein，TAK1蛋白結合蛋白)結合后使TAK1(TGF beta-activated kinase，激活轉化生長因子β蛋白激酶)被激活，而TAB1是TAK1的共同活化劑(coactivator)，具有促進絲裂原活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)1的激活作用，從而通過TAB1/TAK1途徑激活JNK1對抗細胞發生凋亡；③Livin可阻止化療藥物致使的細胞DNA損毀作用導致的細胞凋亡。本研究結果表明，Livin在EMs異位、在位內膜中的陽性表達顯著超過了正常子宮內膜，Livin在前兩組內膜中的表達差異無統計學意義。無論是EMs組還是正常對照組，Livin的陽性表達與月經周期及臨床分期均無關聯。近年來國內外有關Livin在正常內膜及EMs的表達相關報道很少，王春芳等[8]使用免疫組化方法檢測了30例正常子宮內膜及30例EMs在位及異位內膜組織中Livin的表達，結果顯示Livin在正常組中的表達遠低于在位和異位內膜，差異無統計學意義，該實驗結果支持本研究結果。目前己發現Livin在多種腫瘤細胞中異常表達，與腫瘤發生關系密切。Livin在正常組織中表達量很少，但可在肺癌、乳腺癌、消化系統惡性腫瘤、膀胱癌、白血病及淋巴瘤等惡性腫瘤組織中高表達。

3.2第二個線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑Smac基因與子宮內膜異位癥的關系

第2個線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑/低等電點IAP直接結合蛋白(Smac/DIABLO蛋白)是2000年在進行HeLa細胞的實驗中發現的[9]。人類Smac基因定位于12號染色體的長臂，包含7個外顯子，其mRNA全長約1.5kb，編碼了239個氨基酸，其中N端55個氨基酸被稱為線粒體靶序列(mitochondrial targeting sequence，MTS)，其功能在于使未經加工的Smac蛋白確保定位于線粒體，而在Smac移入線粒體后MTS被線粒體內信號肽裂解，最終生成含有184個氨基酸殘基，未加工的Smac蛋白同時獲得凋亡活性。成熟的Smac蛋白以二聚體的形式存在于線粒體的膜間隙，當受到凋亡誘導因子如抗癌藥物、化學或物理的凋亡信號等的作用時釋放入胞漿[3]。Smac因子促進細胞凋亡的機制表現為[10-11]：①Smac的N-末端四肽與Caspase-9 N-末端四肽具有明顯的同源性，通過競爭方式解除對Caspase-9的抑制作用，激活Caspase的級聯反應，促進細胞凋亡的進展；②Smac可促進Pro-caspase-3裂解，促使其產物p24順利裂解得到產物p20/p17，后者能夠與p12共同構成活化的Caspase-3，而活化的Caspase-3反過來又能激活Caspase-9酶原，形成正反饋通路進一步達到促細胞凋亡作用；③Kim(2005年)研究發現Smac因子促進細胞凋亡可能還存在非Caspase依賴方式，推測該方式可能比依賴Caspase途徑的效率更高。本研究結果顯示：Smac在正常子宮內膜、EMs在位內膜和異位內膜的陽性表達明顯呈降低趨勢，組間差異有統計學意義(P<0.05)。Smac在EMs在位和異位內膜中的陽性表達與月經周期及臨床分期無關(均P>0.05)，而在正常子宮內膜中月經分泌期的表達高于增生期(P<0.05)。這與子宮內膜在分泌期凋亡加劇以促使內膜剝脫的理論是一致的[12]。

3.3凋亡抑制蛋白Livin基因和第2個線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑Smac基因的關系

本研究結果顯示，在EMs中Livin和Smac呈負相關。Livin和Smac蛋白均可能通過調節細胞凋亡在EMs的發生中發揮作用，二者可能是EMs發生過程中的重要環節[8]，且二者的協同作用可能促使異位內膜細胞的促凋亡能力減弱，抗凋亡能力增強，導致內膜細胞在異域的增生失控。EMs患者在位和異位內膜細胞凋亡率低、增殖率高，具有生物活性的正常內膜組織細胞隨經血逆流入盆腹腔，在盆腔內不發生凋亡反而繼續存活、種植，造成了異位病灶在此發生、發展。RNAi技術是新近發展的一種分子生物學技術，該技術與特異的mRNA結合使目的基因瓦解，利用這種沉默特定基因技術，為疾病的基因治療提供了新的發展方向。

[參考文獻]

[1]Johnson N P, Hummelshoj L.Consensus on current manage-ment of endometriosis[J].Hum Reprod,2013,28(6):1552-1568.

[2]Chung C Y, Park Y L, Kim N,etal.Expression and prognosticsignificance of Livin in gastric cancer[J].Oncol Rep,2013,30(5):2520-2528.

[3]Vanessa Bake, Stefanie Roesler, Ines Eckhardt,etal.Synergistic interaction of Smac mimetic and IFNα to trigger apoptosis in acute myeloid leukemia cells[J].Cancer Letters,2014,35(52):78-79.

[4]Ding Z Y, Liu G H, Olsson B,etal.Upregulation of the antiapoptotic factor Livin contributes to cisplatin resistance incolon cancer cells[J].Tumour Biol,2013,34(2):683-693.

[5]李仙麗,焦伊勝,王永來等.Livin與Smac在子宮內膜異位癥中的表達及意義[J].中國醫科大學學,2010,39(5):362-365.

[6]Lin H, Lin D, Xiong X.Differential expression of Livin, caspase-3, and second mitochondria-derived activator of caspasesin chronic rhinosinusitis with nasal polyps[J].Otolaryng Head Neck,2014,151(6):1067-1072.

[7]馬一倩,汪莉,馬宏,等.FAF1、Livin蛋白在胃癌組織中的表達及臨床意義[J].山西醫科大學學報,2014,45(3):173-176,247.

[8]趙倩,邊愛平,王春芳.子宮內膜異位癥患者內膜組織中Livin和Smac蛋白的表達[J].鄭州大學學報(醫學版),2011,46(2):228-230.

[9]Hu W, Wang F, Tang J,etal.Pro-apoptotic protein, Smac, mediates apoptosis in cisplatin-resistant ovarian cancer cells when treated with the anti-tumor agent, at101[J].J Biol Chem,2012,287(1):68-80.

[10]Bram Laukens, Claudia Jennewein, Barbara Schenk,etal.Smac Mimetic Bypasses Apoptosis Resistance in FADD- or Caspase-8-Deficient Cells by Priming for Tumor Necrosis Factor α-Induced Necroptosis[J].Neoplasia,2011,13(10):370-371.

[11]Simone Fulda.Smac mimetics as IAP antagonists[J].Seminars in Cell and Developmental Biology,2014,23(6):1338-1339.

[12]張麗,石彬,任秀朋,等.XlAP.XAFl、TNF-α在子宮內膜異位癥發病機制中的作用[J].中國計劃生育學雜志,2012,20(9):604-607.

[專業責任編輯：張冠軍]

[收稿日期]2016-01-20

[作者簡介]祝平(1980-)，女，主治醫師，碩士，主要從事婦產科臨床工作。

[通訊作者]沈樹娜，主任醫師。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.04.017

[中圖分類號]R711.71

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5293(2016)04-0466-04

Expressions of Livin and Smac and their correlation in endometriosis

ZHU Ping, SHEN Shu-na

(Department of Gynecology and Obstetrics, Inner Mongolia Baogang Hospital, Inner Mongolia Baotou 014010, China)

[Abstract]Objective To explore the expressions of new member of apoptosis inhibiting protein family Livin and second mitochondrial activator of caspase (Smac) in EMs and and analyze the relationship between their expressions and menstrual cycle as well as EMs clinical staging. Methods In the Third Affilated Hospital of Inner Mongolia Medical College, 60 cases of EMs confirmed by pathological results after lapascopic surgery or abdominal surgery were selected in study group. Thirty samples of ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs (16 samples in proliferative phases and 14 samples in secretive phases) were collected in study group and another 30 samples of normal endometrium tissues were collected in control group. The method of immunohistochemistry was used to determine the expressions of Livin and Smac proteins. All statistical analyses were carried out with SPSS16.0 software. Results The expressions of Livin in ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs group were significantly higher than in the control group with statistical significance (χ2=12.510, P<0.05). But the expressions of Smac in ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs group were significantly lower than in the control group with statistical significance (χ2=19.530,P<0.05). Both in ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs group and the control group, the expressions of Livin and Smac were not correlated with clinical staging (χ2 value was 0.741 and 0.002, respectively, both P>0.05). In study group the expression of Livin was negatively correlated with that of Smac both in ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs (rs value was -0.933 and -0.867, respectively, both P<0.05). Conclusion The high expression of Livin and low expression of Smac strengthen the ability of hyperplasia of endometrial cells and antiapoptotic capacity, which leads to the occurrence and development of EMs.

[Key words]endometriosis (EMs); inhibitor of apoptosis proteins (IAPs); second mitochondrial activator of caspase (Smac); immunohistochemistry