在斑馬魚仔魚腦部異體移植胚胎細胞的嘗試

曹靜暉，魏雅嵐，嚴繼舟

(上海海洋大學水產與生命學院生物系，上海　201306)

?

在斑馬魚仔魚腦部異體移植胚胎細胞的嘗試

曹靜暉，魏雅嵐，嚴繼舟

(上海海洋大學水產與生命學院生物系，上海201306)

摘要：為建立斑馬魚(Danio rerio)腦部細胞移植模型，先用紅色熒光染料標記供體胚胎細胞，再移植細胞到AB品系和兩種轉基因斑馬魚仔魚腦部。熒光顯微鏡和組織學切片觀察發現移植細胞沿組織或細胞間隙而不是通過血管向周圍組織擴散，但細胞增殖分化不明顯。在細胞移植24 h后，腦部組織學結構與對照組無明顯差別。帶有白血病基因的胚胎細胞在AB仔魚的腦部沒有產生腫瘤樣增生和轉移。相比之下，正常胚胎細胞在白血病模型的仔魚腦部非白血病細胞聚集區出現較多增殖和遷移。這些結果提示腦局部微環境不支持移植細胞的增殖分化；細胞移植只能彌補局部細胞的空疏而不能用作細胞替代治療。

關鍵詞：斑馬魚(Danio rerio);胚胎細胞;細胞移植;腦;白血病

神經退行性疾病是一類以神經元退行性病變或凋亡,從而導致腦功能和腦結構的逐步喪失，個體行為異常乃至死亡為主要特征的疾病。隨著社會逐漸步入老齡化,神經退行性疾病的發病率不斷攀升，目前尚無有效的治療措施。干細胞研究的迅速發展為這類疾病的治療提供了新的研究途徑，多種干細胞治療神經退行性疾病動物的嘗試尚在進展中[1]。

干細胞是機體在發展適應過程中保留的一部分未分化的原始細胞，具有全部或部分分化能力。在一定條件下這些干細胞可以在體外持續性增殖和分化成多種功能的細胞或組織器官。臨床上可以用自身或他人的干細胞和干細胞衍生物替代、修復病變的神經組織,以恢復其生理功能，即干細胞移植治療，為傳統醫學方法難以醫治的中樞神經系統疾病提供了十分廣闊的臨床治療前景[2]。

斑馬魚(Daniorerio)和人類的基因在關鍵區域存在100%的同源性，大約70%的人類基因在斑馬魚體內都對應著至少一個同源基因，這使其成為研究人類疾病的重要模式生物。使用斑馬魚作為研究對象還有許多優勢，諸如繁殖快，飼養成本低廉；胚胎和仔魚半透明便于生物光信號可視化，可以在高分辨率的共聚焦顯微鏡下研究細胞在組織中的擴散[3]。更為重要的是斑馬魚與脊椎動物的免疫系統存在許多共同點，但更適合于異體細胞移植實驗。斑馬魚的免疫系統只在受精4～6周后才能在形態和功能上發育成熟，因此異體移植實驗在斑馬魚發育前期進行時，不需要免疫抑制處理[4-5]。

斑馬魚胚胎和仔魚的異種移植模型已被廣泛用于研究腫瘤的發生、發展和復發[6]。多種腫瘤細胞在移植到斑馬魚胚胎和仔魚體內時，會增殖、形成囊塊、誘導血管生成，并擴散；人類黑色素瘤細胞、結腸癌細胞、胰腺癌細胞移植到受精后2 d斑馬魚的卵黃囊時，會增殖擴散并形成囊塊，并且在囊塊內部斑馬魚的血管內皮細胞會被誘導生成[7]；人類和鼠類的腫瘤細胞在移植到受精后48 h的斑馬魚的腸下靜脈附近時，其所表達生血管成纖維細胞生長因子和血管內皮生長因子會誘導新的微脈管系統的快速形成[8]；乳腺癌細胞系移植到斑馬魚胚胎后，遷移到胚胎的尾部形成囊塊[9]；人類膠質瘤細胞在移植到斑馬魚胚胎后，能增殖生成腫瘤，且這些腫瘤能誘導血管新生[10]；向發育中的斑馬魚移植具有擴散性的黑色素瘤細胞，后者會分泌一種強力的胚胎類似物，導致胚胎體軸的發育異常[11]。斑馬魚異種移植模型也被用來代替鼠類模型，快速高效得評估人類多能干細胞來源的內皮細胞的功能[12]。不同于上述的異種移植，本實驗將研究斑馬魚同種異體腦部移植胚胎細胞的可行性。通過建立斑馬魚腦部異體移植胚胎細胞的模型，為人類神經退行性病變的治療提供參考。

1材料與方法

1.1試驗試劑和儀器

乙醇95%，無水乙醇，二甲苯(上海高信化玻儀器有限公司)；Dextran,Texas Red?,10,000 MW(D1864，Life Technologies，美國)；MicroInjectorTM(Tritech Research，美國)；glass capillary (WorldPrecisionInstruments，美國)；Sutter P-97 Pipette Puller(WorldPrecisionInstruments，美國)；M-152Manipulator (NARISHIGE，日本)；CellTram?Air (Eppendorf，德國)；MIC01056倒置顯微鏡(Carl Zeiss Jena，德國)。

史密斯固定液配制：重鉻酸鉀875μL、甲醛100 μL、乙酸25 μL。

1.2試驗材料

本實驗使用的三種不同品系的斑馬魚均來源于本實驗室飼養，分別為野生型斑馬魚(AB系)，血管熒光型斑馬魚(FLK1啟動子驅動的GFP轉基因魚)和MLL-AF9-GFP轉基因斑馬魚(AF9)。

1.3方法

1.3.1供體細胞的準備

選取發育至1 k細胞期的胚胎細胞作為移植供體。按先前報道的方法收集魚卵[13]，然后固定在瓊脂糖凝膠槽中。待其發育至16細胞期，使用顯微注射儀，將熒光染料葡聚糖德克薩斯紅(可被激發出紅色熒光)注射到魚卵的卵黃囊中，用于追蹤胚胎細胞系。待其發育至1 k細胞期，供細胞移植使用。

1.3.2細胞受體的準備

斑馬魚仔魚作為細胞移植受體，即斑馬魚卵受精后發育至48 h(48 hpf)，接受細胞移植實驗。

1.3.3細胞移植設備的準備

使用拉針儀將玻璃毛細管拉斷為兩根細胞移植用針，用鑷子為針尖開口，口徑應大于移植細胞的直徑，將針裝配到氣壓細胞移植設備上，并固定于顯微操作設備上，調整氣壓，使針孔內外氣壓達到平衡。

1.3.4細胞移植

在體視顯微鏡下，將受體仔魚固定在瓊脂糖凝膠槽上，使用細胞移植設備，抽取供體魚卵動物極中的細胞，移植到受體幼魚的腦部，再在倒置顯微鏡下追蹤觀察斑馬魚仔魚腦部的熒光信號[14-18](圖1)。共成功進行移植實驗的斑馬魚仔魚62尾，并且存活至移植后24 h以上。

圖1　細胞移植示意圖

示供體細胞染色(a)、供體細胞吸取(b)和顯微注射三個階段(c)。

1.3.5斑馬魚仔魚石蠟切片

接受移植的斑馬魚仔魚放入1.5 mL離心管，移除多余水分，在1 mL史密斯固定液中固定12 h；實驗仔魚固定好后，移除史密斯固定液，加入0.5 mL 30%～100%乙醇梯度脫水、二甲苯透明和包埋。包埋時，使斑馬魚仔魚側著躺平，使用石蠟切片機從斑馬魚仔魚的左側到右側連續切片切、蘇木精-伊紅(HE)染色和封片后對細胞移植部位進行拍照[19]。

1.3.6斑馬魚仔魚細胞移植取樣時間及樣本數量的選擇

根據斑馬魚飼養光照晝夜時間，我們選擇在中午讓斑馬魚進行交配產卵。收集供體胚胎發育至1 k細胞期進行移植試驗。根據預實驗結果，選擇在移植后1 h取樣進行熒光或連續切片觀察細胞移植情況，以后每6 h繼續取樣觀察細胞的移植情況，連續3 d。對照和不同時間段移植的斑馬魚每組觀察至少有三尾活體樣本，中途死亡的需要補做移植試驗。

2結果

2.1腦部細胞移植的活體觀察

為了活體觀察腦部移植細胞與血管的關系，按圖1所示在Flk1-GFP轉基因斑馬魚腦部移植Texas Red標記的葡聚糖染色的胚胎細胞。在細胞移植后1 h，斑馬魚仔魚的腦部前端可以觀察到帶有紅色熒光信號的一團移植細胞；在細胞移植后18 h，斑馬魚仔魚腦部前端的細胞團已擴散到斑馬魚的整個腦部，擴散細胞的位置與腦部血管分布(綠色信號)之間沒有明顯聯系。對照組顯示了血管在斑馬魚仔魚腦部的分布情況(圖2)。

圖2　接受細胞移植的FLK1斑馬魚仔魚腦部的熒光觀察

2.2細胞移植的組織學觀察

為了明確細胞移植后的腦部組織學變化，對上述細胞移植的斑馬魚腦組織進行組織學切片和HE染色觀察。在細胞移植后1 h，與對照組相比，接受細胞移植的斑馬魚仔魚在腦部的腦間隙和腦室中發現了移植細胞，而在對照組的腦間隙和腦室中沒有發現任何細胞。移植細胞與周圍正常腦細胞相比，正常腦細胞的細胞質偏噬堿性，而移植細胞的細胞質偏噬酸性。在HE染色后，正常腦部細胞偏藍，而移植細胞偏紅，且移植細胞的核質比較大。在細胞移植6 h后，移植細胞開始出現擴散現象，周圍正常腦部組織中開始出現移植細胞，其仍保持細胞質偏紅的特征。在細胞移植18 h后，部分接受移植的斑馬魚仔魚的腦室中還殘留著少量移植細胞，在周圍正常的腦部組織中也能找到一些移植細胞，它們的特征并未發生明顯改變。在細胞移植后24 h后，腦室中已找不到移植細胞，在腦室周圍的組織中仍能發現部分移植細胞，這些移植細胞仍保持著原有特征，在組織結構上，接受細胞移植的斑馬魚仔魚和對照組中的斑馬魚仔魚已無區別(圖3)值得注意的是，整張切片沒有發現炎性浸潤和炎癥反應，說明移植細胞的減少并非免疫排斥。

2.3正常仔魚移植AF9細胞的熒光顯微鏡觀察結果

為了檢驗癌細胞移植后的浸潤性，將人類白血病融合基因MLL-AF9-GFP轉基因斑馬魚的胚胎細胞染色后注射到正常AB斑馬魚(圖4)。在細胞移植后1 h，斑馬魚仔魚的腦部前端可以觀察到帶有紅色熒光信號的兩團移植細胞；在細胞移植后18 h，斑馬魚仔魚腦部前端只能觀察到少量移植細胞；在細胞移植后24 h，斑馬魚仔魚腦部前端移植細胞的信號幾乎消失了。

2.4 AF9-GFP仔魚移植正常細胞的熒光顯微鏡觀察結果

隨后又檢測了正常AB魚胚胎細胞移植到MLL-AF9轉基因斑馬魚后的生長情況(圖5)。對照組(0 hpt)顯示了細胞移植前MLL-AF9基因在斑馬魚仔魚腦部的表達位置。在細胞移植后1 h，斑馬魚仔魚的腦部前端可以觀察到帶有紅色熒光信號的一片移植細胞；在細胞移植后18 h，斑馬魚仔魚腦部前端能觀察到少量聚集的細胞；在細胞移植后24 h，聚集的細胞團變大，移植細胞出現了少許增殖現象。移植細胞與MLL-AF9細胞不在同一區域。

圖4　AF9供體細胞移植到AB受體幼魚腦部的熒光觀察

hpf表示hours post fertilization，hpt表示hours post transplant，0 hpt為對照，沒有移植的正常AB仔魚。

圖5　AB供體細胞移植到AF9受體仔魚腦部的熒光觀察

3討論

本實驗的目的是想利用斑馬魚為模型研究干細胞移植治療腦神經細胞退化的可行性。為此首先檢驗了干細胞移植后的致癌性，其次是移植細胞增生分化和細胞替代治療的能力。

許多報道顯示人類腫瘤細胞移植入斑馬魚胚胎、仔魚或肝臟都表現出侵潤和微轉移現象[20]；斑馬魚胚胎移植人類惡性膠質瘤細胞和其中的膠質瘤干細胞后，在膠質瘤干細胞的促進下，膠質瘤細胞沿斑馬魚胚胎的血管快速擴散，并表現出強烈的侵潤性[21]；膠質瘤細胞可以在斑馬魚胚胎中存活、增殖并誘導血管分支的形成[22]。

MLL-AF9是一種白血病基因，MLL-AF9在人類CD34+細胞中表達會引起嚴重的淋巴系白血病、髓系白血病或混合型白血病。本次實驗將轉人類MLL-AF9-GFP基因的斑馬魚的胚胎細胞移植到正常AB品系斑馬魚仔魚腦部，同時也將正常AB品系斑馬魚的胚胎細胞移植到MLL-AF9-GFP轉基因的斑馬魚仔魚的腦部，以此觀察帶有白血病基因的細胞在正常斑馬魚體內的致病性和正常的斑馬魚細胞治療白血病基因表達細胞的可能性。細胞移植結果顯示帶有白血病的細胞在正常斑馬魚仔魚的腦部沒有增殖的跡象，移植細胞數量逐漸減少，無法像癌細胞一樣形成囊塊；相反移植到MLL-AF9-GFP轉基因斑馬魚仔魚的腦部的正常胚胎細胞表現出有限增殖。雖然移植細胞團逐漸增大，但遠離轉基因細胞團。這些結果不僅證實微環境對于白血病干細胞的影響較大[23]，也提示移植的胚胎細胞和轉基因細胞分屬兩個不同微環境，而斑馬魚體內微環境更適合于正常細胞移植和生成。

MLL-AF9轉基因魚細胞移植實驗說明斑馬魚有很強抗癌變和抗外源細胞整合的能力。許多報道也發現正常細胞和多種干細胞及少部分腫瘤細胞，移植到斑馬魚胚胎和仔魚后只能增殖和擴散，無法形成囊塊，也很少整合到斑馬魚組織。人類成纖維細胞移植到受精后2 d斑馬魚的卵黃囊時，會發生遷移，但不會增殖擴散并形成囊塊[7]；人類脂肪干細胞在移植到斑馬魚胚胎時，不僅能夠存活和增殖，而且在短時間內保持其未分化的狀態[24]；人類嚴重髓性白血病細胞和胚細胞移植到受精后48 h的斑馬魚體內時，會停留在循環系統內數日，且不影響斑馬魚的發育[25]；人類黑色素瘤細胞在移植到斑馬魚囊胚期胚胎時，存活并擴散，但黑色素瘤細胞并沒有形成腫瘤或整合入宿主器官，而是分散在細胞間隙中，傾向于分布在正常的皮膚微環境[26]；人類胚胎干細胞來源的內皮細胞異種移植到斑馬魚胚胎后，只能形成不穩定的管脈系統，不能整合入斑馬魚的血管[27]；人類纖維細胞移植入斑馬魚胚胎后，遷移并增殖，但沒有整合入宿主的組織[28]。

不同于上面人類細胞的異種移植實驗，我們采用的是同種異體移植，即注射斑馬魚發育至1 k細胞期的胚胎細胞到受精后48 h的斑馬魚頭部。移植的胚胎細胞表現出了擴散的現象，且其擴散位置與血管分布沒有明顯關系；移植的胚胎細胞一直保持其原有特征，沒有表現出明顯的分化現象和致瘤性。移植后表現出的低增殖少分化的現象也可能預示移植的胚胎細胞中含有胚胎干細胞功能的數量太少。有研究指出在發育至4細胞期后，斑馬魚胚胎中只有部分細胞表達胚細胞信號[29]。但加大細胞移植量移植24 h后，其腦部結構形態和對照組并無區別，說明微環境不適應應該是決定因素。

總之，斑馬魚胚胎細胞注射到斑馬魚仔魚腦部后會沿著組織間隙遷移并擴散到周圍的腦部組織中。雖然不能肯定移植細胞的最終去向，但推測這些胚胎細胞可能大部分凋亡，少量整合入正常的組織。我們認為腦部細胞移植只能彌補少量的細胞空缺，并不能替代治療已有的細胞(包括不正常細胞)。腦細胞移植的效果取決于局部微環境改善，也就是說，治療神經退行性病變通過注射干細胞代謝物刺激神經再生應該更有前途。但斑馬魚的腦部環境畢竟與人類不同，我們的推測有待進一步的臨床檢驗。

致謝：感謝上海海洋大學海洋生物系統和神經研究所范純新和張慧對于本實驗圖片拍攝方面的指導，感謝呂愷倫和高思琪在顯微注射和石蠟切片技術方面的指導。

參考文獻：

[1]熊杰，寧麗娜，王再領，等．干細胞治療神經退行性疾病的前景與問題[J]．中國組織工程研究，2013，17(19)：3573-3580．

[2]張寶華，仇福成，董慈，等．腦脊液途徑移植神經干細胞治療中樞神經系統疾病的研究現狀[J]．中國組織工程研究，2014，18(6)：974-978．

[3]Stoletov K，Montel V，Lester R D，et al．High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(44)：17406-17411．

[4]Lam S H，Chua H L，Gong Z，et al．Development and maturation of the immune system in zebrafish，Danio rerio：A gene expression profiling，in situ hybridization and immunological study[J]．Dev Comp Immunol，2004，28(1)：9-28．

[5]Renshaw S A，Trede N S．A model 450 million years in the making：Zebrafish and vertebrate immunity[J]．Dis Models Mech，2012，5(1)：38-47．

[6]Konantz M，Balci T B，Hartwig U F，et al．Zebrafish xenografts as a tool forinvivostudies on human cancer[J]．Ann New York Acad Sci，2012，1266：124-137．

[7]Haldi M，Ton C，Seng W L，et al．Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate，migrate，produce melanin，form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish[J]．Angiogenesis，2006，9(3)：139-151．

[8]Nicoli S，Ribatti D，Cotelli F，et al．Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos[J]．Cancer Res，2007，67(7)：2927-2931．

[9]Eguiara A，Holgado O，Beloqui I，et al．Xenografts in zebrafish embryos as a rapid functional assay for breast cancer stem-like cell identification[J]．Cell Cycle，2011，10(21)：3751-3757．

[10]Geiger G A，Fu W，Kao G D．Temozolomide-mediated radiosensitization of human glioma cells in a zebrafish embryonic system[J]．Cancer Res，2008，68(9)：3396-3404．

[11]Topczewska J M，Postovit L M，Margaryan N V，et al．Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling：Role in melanoma aggressiveness[J]．Nat Med，2006，12(8)：925-932．

[12]Orlova V V，Drabsch Y，ten Dijke P，et al．Assessment of functional competence of endothelial cells from human pluripotent stem cells in zebrafish embryos[J]．Methods Mol Biol，2014，1213：107-119．

[13]邵貝麗，嚴繼舟．轉基因斑馬魚側線系統的形成及其對新霉素的抗性[J]．淡水漁業，2014，44(1)：41-45．

[14]Mizuno T，Shinya M，Takeda H．Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos[J]．Methods Mol Biol，1999，127：15-28．

[15]Carmany-Rampey A，Moens C B．Modern mosaic analysis in the zebrafish[J]．Methods，2006，39(3)：228-238．

[16]Deschene E R，Barresi M J．Tissue targeted embryonic chimeras：Zebrafish gastrula cell transplantation[J]．J Vis Exp，2009，(31)：1422．

[17]Kemp H A，Carmany-Rampey A，Moens C．Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation[J]．J Vis Exp，2009，(29)：1394．

[18]Hong N，Chen S，Ge R，et al．Interordinal chimera formation between medaka and zebrafish for analyzing stem cell differentiation[J]．Stem Cells Dev，2012，21(12)：2333-2341．

[19]Zhang H，Wang X L，Lyu K，et al．Time point-based integrative analyses of deep-transcriptome identify four signal pathways in blastemal regeneration of zebrafish lower jaw[J]．Stem Cells，2014，33(3)：806-818．

[20]Marques I J，Weiss F U，Vlecken D H，et al．Metastatic behaviour of primary human tumours in a zebrafish xenotransplantation model[J]．BMC Cancer，2009，9：128．

[21]Yang X J，Cui W，Gu A，et al．A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion[J]．PLoS One，2013，8(4)：e61801．

[22]Li D，Li X P，Wang H X，et al．VEGF induces angiogenesis in a zebrafish embryo glioma model established by transplantation of human glioma cells[J]．Oncol Rep，2012，28(3)：937-942．

[23]Wei J，Wunderlich M，Fox C，et al．Microenvironment determines lineage fate in a human model of MLL-AF9 leukemia[J]．Cancer Cell，2008，13(6)：483-495．

[24]Li J，Zeng G，Qi Y，et al．Xenotransplantation of human adipose-derived stem cells in zebrafish embryos[J]．PLoS One，2015，10(4)：e0123264．

[25]Pruvot B，Jacquel A，Droin N，et al．Leukemic cell xenograft in zebrafish embryo for investigating drug efficacy[J]．Haematologica，2011，96(4)：612-616．

[26]Lee L M，Seftor E A，Bonde G，et al．The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos：Assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation[J]．Dev Dyn，2005，233(4)：1560-1570．

[27]Orlova V V，Drabsch Y，Freund C，et al．Functionality of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells demonstrated in cultured vascular plexus and zebrafish xenografts[J]．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014，34(1)：177-186．

[28]Benyumov A O，Hergert P，Herrera J，et al．A novel zebrafish embryo xenotransplantation model to study primary human fibroblast motility in health and disease[J]．Zebrafish，2012，9(1)：38-43．

[29]Yoon C，Kawakami K，Hopkins N．Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells[J]．Development，1997，124(16)：3157-3165．

(責任編輯：鄧薇)

收稿日期：2015-09-28；

修訂日期：2016-04-07

第一作者簡介：曹靜暉(1992-)，理學學士，專業方向為水生生物學。E-mail:ccjjhh001@sina.com 通訊作者：嚴繼舟。Email:jyan2@shou.edu.cn

中圖分類號：S917.4

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)04-0003-06

Trials on embryo cell allotransplantations in Danio rerio larval brain

CAO Jing-hui,WEI Ya-lan,YAN Ji-zhou

(DepartmentofBiology,CollegeofFisheriesandLifeSciences,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Abstract：To establish a brain cell transplant model,here Danio rerio embryo cells were labeled with red fluorescent dye and separately transplanted into the larval brains of AB line and two different transgenic D.rerio.Fluorescence microscopic and histological observations showed the transplanted cells were migrated along interstitial/intercellular space instead of blood vessels,revealing little proliferation and differentiation.24 hours after transplantation,the brain histological structure looked similar to the control.The transplanted embryo cells from the leukemia transgenic fish did not display any neoplasm proliferation and metastasis in AB larvae.In comparison,the transplant cells from AB lines showed a bit more proliferation and migration at the region far from leukemia cell aggregate in the brain of leukemia transgenic fish.These results suggested that the brain microenvironment was not suitable for the growth of the cell transplants,thereby cell transplant cannot replace the existing cells but fill a few cell sparsities.

Key words：Danio rerio;embryo cell;cell transplant;brain;leukemia

資助項目：上海海洋大學大學生創新項目(A-0218-12-0001-003)；上海海洋大學斑馬魚再生技術啟動基金(A-2400-12-0007)