水體pH對中華絨螯蟹幼蟹蛻殼生長及其相關基因表達的影響

劉金生,王　軍,岳武成,陳　嬌,黃　姝,慈元吉,王成輝

(上海海洋大學，農業部淡水水產種質資源重點實驗室，上?！?01306)

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水體pH對中華絨螯蟹幼蟹蛻殼生長及其相關基因表達的影響

劉金生,王軍,岳武成,陳嬌,黃姝,慈元吉,王成輝

(上海海洋大學，農業部淡水水產種質資源重點實驗室，上海201306)

摘要：為了解養殖水體pH值對中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)蛻殼生長及其相關基因表達的影響，在試驗室水槽條件下，設定pH=7、8、9、10(均無水草)為實驗組，以種植適量水草(pH值為8.2～9.1)為對照組，研究中華絨螯蟹幼蟹(均重0.43 g±0.09 g)在不同pH值水體中飼養一個蛻殼周期(37 d)的蛻殼生長及其相關基因(蛻皮抑制激素MIH,蛻皮激素受體EcR,維甲類X受體RXR，胰島素樣生長因子IGF2)表達情況。結果顯示，對照組河蟹的成活率和增重率均顯著高于實驗組，其中，pH10的河蟹成活率和增重率最低。熒光定量PCR檢測顯示，MIH、EcR和RXR基因在不同pH水體的表達存在顯著差異，IGF2基因在不同pH水體中的表達無顯著差異；不同pH水體幼蟹的增重率與成活率之間存在顯著正相關，EcR、RXR與IGF2基因相互間的表達量存在顯著正相關，表明這三個基因的表達具有協同作用。通過對成活率、增重率和基因表達的綜合分析認為幼蟹生長的最適pH為8～9。

關鍵詞：中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)；pH值；水草；蛻殼；生長；基因表達

水體pH是水產生物生存環境的重要生態因子，對水產生物的成活率和生長率[1-2]，甚至對酶活性和基因表達[3-4]均會產生影響。如羅氏沼蝦在pH 6.8的水體飼養56 d后，其蛻殼頻率和增重率顯著低于pH 7.4和8.2的養殖水體[1]，中國對蝦在pH 7.0和pH 9.0脅迫148 h時其鰓、肌肉和血細胞中的HSP90基因表達均上調[4]。中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹，是我國一種重要的水產經濟生物。水體pH值對其生長發育也有重要影響，不同pH會影響幼蟹發育和非特異性免疫等[5-6]，高pH會影響河蟹蛋白質和氨基酸的代謝水平，降低血淋巴總蛋白和血藍蛋白的含量[7]，高pH還能導致河蟹氧化應激改變體色[8]。據報道，生產上河蟹的適宜pH值為6.5～9.5[9-11]，此pH值范圍跨度較大，是一種生產實踐中的經驗總結和推論，尚缺乏嚴格的實驗驗證。

另一方面，水草是河蟹養殖中一個重要生態因子，它不僅提供豐富的餌料、良好的棲息和隱蔽場所，而且有改善水質，減少水體有害物質等作用[12]。同時，水草對池塘pH也有重要影響。如王傳海等[13]報道，種有苦草的水體日平均pH值明顯高于無水草水體。

生物的生長發育受外界環境因子的影響，同時也受體內基因的調控。河蟹屬于甲殼動物，其生長與蛻殼密切聯系，即河蟹的生長有賴于蛻殼的次數和蛻殼后體長和體質量的增加程度[14]，而蛻殼過程主要是受蛻皮激素、蛻皮抑制激素(MIH)、蛻皮激素受體(EcR)、維甲類X受體(RXR)等基因的調控[15]。然而，這些蛻殼相關基因在不同pH下是否存在表達差異，目前尚不清楚。此外，胰島素樣生長因子(IGFs)作為一類多功能細胞增殖調控因子，在細胞分化、增殖、個體生長發育中具有重要的促進作用[16]，但其在甲殼動物蛻殼生長中的作用亦未見報道。

本實驗擬在人工控制的實驗室條件下，探究不同水體pH對幼蟹蛻殼、生長及其相關基因表達的影響，探討水草(pH方面)在河蟹養殖中的作用機制，以期為河蟹生態養殖提供參考和依據。

1材料與方法

1.1實驗設置

本研究在實驗室的60 L長方體水箱(52 cm×36 cm×32 cm)中進行。實驗共設5組，其中以pH=7、8、9和10為實驗組，用0.5 mol/L NaOH和0.5 mol/L HCl調節水體pH，無水草種植；以種植適量水草(苦草)為對照組。每組設置3個重復(共15個實驗水箱)，每個水箱內放養24只幼蟹(雌雄蟹各12只)，共飼養幼蟹360只。

1.2飼養方法

實驗蟹來自上海海洋大學水產動物種質實驗站的良種選育系仔蟹，體重(0.43±0.09) g。每個養殖水箱中間均放置1個長形拱狀瓦片作為隱蔽物，以減少蛻殼過程中的互相殘殺。每日早晚定時各投喂1次適量的河蟹專用配合飼料，并及時清理殘渣和排泄物。實驗水源為河水(pH值在7.6左右)，每隔3 d換水一次(預先調好pH)，實驗期間連續充氧。每日測量2次水體pH并進行調節，同時測量對照組pH值(實驗期間的pH范圍為8.2～9.1，平均為8.5)。實驗日期為2014年7月1日—2014年8月6日，共37 d。

1.3生長測定與組織樣本采集

每天記錄實驗幼蟹的蛻殼和死亡情況，及時將蛻殼前期和蛻殼后不久的蟹用網袋隔離開，第2天待殼硬化后測量體重，然后放回原水箱養殖。第二次蛻殼時，同樣先用網袋隔離，然后在第2天待殼硬化后時測量體重，并取其眼柄和肝胰腺組織放于-80 ℃冰箱備用。

1.4熒光定量PCR分析

總RNA提取采用Axygen-RNA試劑盒，反轉錄采用PrimeScript?RT reagent Kit試劑盒(大連寶生物公司)。根據已報道的與蛻殼生長相關的基因序列[17-19]設計引物(表1)用于熒光定量PCR檢測。本研究分析了眼柄中的蛻皮抑制激素(MIH)，肝胰腺中的蛻皮激素受體(EcR)、維甲類X受體(RXR)和胰島素樣生長因子2(IGF2)基因。熒光定量PCR反應條件如下：預變性95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,共40個循環;72 ℃ 10 min，溶解曲線60～94 ℃。

表1　熒光定量PCR引物序列與反應特性

1.5數據處理

蛻殼間期(d)為各組河蟹第二次蛻殼的平均日期與第一次蛻殼的平均日期之差。熒光定量結果按2-ΔΔCt法進行分析[20]。生長數據和基因表達數據均用平均值±標準差表示，用Excel、SPSS 20對這些數據進行單因素方差分析(ANOVA)、顯著性檢測和相關分析。

2結果與分析

2.1生長情況觀察

經過37 d的實驗，發現實驗組中以pH 8的成活率最高(76.39%)，pH 10的成活率最低(51.39%)，但均低于對照組(83.33%)(P<0.05)。不同pH實驗組的增重率也存在較大變化，pH 9的增重率最高(140.90%)，其次是pH 7(139.28%)和pH 8(132.69%)，但相互間不存在顯著差異，而pH 10的增重率顯著低于其它pH實驗組(102.23%)。但所有四種pH實驗組的增重率均顯著低于對照組(226.13%)(P<0.05)表2。

通過統計前后兩次蛻殼間的蛻殼間期如圖1所示，發現對照組的蛻殼間期最短，平均為9.7 d，實驗組中pH 7的蛻殼間期最長(平均13.8 d)，pH 8的蛻殼間期(13.2 d)高于pH 9(12.0 d)和pH 10(9.8 d圖1)。

圖1　四種不同pH實驗組與對照組(水草)的蛻殼間期

pH7pH8pH9pH10對照組實驗前規格/g0.44±0.030.47±0.030.41±0.030.35±0.030.41±0.01變異系數/%21.0518.8520.4521.2219.65個數7272727272實驗后規格/g1.07±0.121.11±0.070.98±0.060.69±0.061.32±0.06變異系數/%24.3925.9124.7735.7521.05個體4455483760成活率/%61.1176.3966.6751.3983.33絕對增重/g0.610.620.570.360.92相對增重/%139.28132.69140.90102.23226.13

2.2蛻殼生長相關基因的表達分析

熒光定量PCR表達結果檢測顯示，MIH、EcR和RXR基因的表達水平與pH密切相關，IGF2基因在不同pH組中的表達無顯著差異(表3和圖2)。MIH基因在對照組中的表達量顯著高于各pH實驗組(P<0.05)，但在各pH實驗組間無顯著表達差異(P>0.05)。EcR基因在pH 10的表達量顯著高于其它組(P<0.05)，而在pH 8的表達量最低。RXR基因在pH 9的表達量顯著高于其他pH水體(P<0.05)，同樣在pH 8的表達量最低。IGF2基因在不同pH組和對照組中的表達均無顯著差異(P>0.05)，但以pH 9的表達量最高。進一步分析基因間的表達關系，發現EcR和RXR基因的表達量存在相同的表達關系(r=0.654,P<0.01)，只有在pH 10組存在相反的表達關系(圖3)。

2.3相關性分析

將生長相關數據與基因表達量進行相關分析(表4)顯示，增重率與成活率之間存在顯著正相關(r=0.729,P<0.01)，即成活率越大，反映生長環境條件較好，有利于河蟹生長，從而增重率越高。EcR、RXR與IGF2基因相互間表達量存在顯著正相關(r=0.654～0.868,P<0.01)，表明這三個基因的表達具有協同作用。MIH基因表達與增重率之間存在顯著正相關(r=0.748,P<0.01)，與蛻殼間期之間存在顯著負相關(r=-0.528,P<0.05)；EcR基因表達與成活率、增重率之間存在顯著負相關(r=-0.591～-0.601,P<0.05)，表明MIH基因高表達，而EcR基因低表達時蛻殼間期變短，成活率越高，有利于河蟹的生長。

表3　基因表達量在不同pH水體的單因素方差分析結果

圖2　相關基因在不同pH水體的表達

圖3　EcR和RXR基因的表達關系

成活率增重率蛻殼間期MIH基因EcR基因RXR基因增重率0.729**蛻殼間期0.106-0.249MIH基因0.5120.748**-0.528*EcR基因-0.601*-0.591*-0.246-0.538RXR基因0.0080.1830.180-0.2400.654**IGF2基因0.0590.0230.142-0.2740.664**0.868**

注：**表示相關性極顯著(P<0.01)，*表示相關性顯著(P<0.05).

3討論

pH是水生動物生長環境中重要的理化因子，動物的生長發育在一定程度上受到水環境pH的影響。而在水生甲殼動物中，蛻殼間期常常作為其生長發育水平的階段性衡量標準。本研究的不同pH實驗組中，其河蟹的蛻殼間期隨水體pH的升高逐漸縮短且顯著負相關。該結果與董雙林等[21]在日本沼蝦中的研究結果一致，其研究認為適度的高pH誘導的高蛻殼頻率可能與加速的甲殼動物甲殼鈣化相關。有研究結果顯示，水體pH值對水生甲殼動物生長的影響可能是通過影響其能量攝入多少以及攝食能用于生長的比例來實現，即在一定范圍內水生甲殼動物攝食及用于生長的能量隨著pH值的增大而增加[22]，其外在表現為成活率升高以及體重的增加，本實驗結果與之一致。如在本實驗中，增重率在pH 9時達到最高，在pH 10卻降低，這說明pH誘導在一定范圍內會加速河蟹的蛻殼，而過高(pH 10時)可能會在一定程度抑制生長。綜上，在一定范圍內，pH增加有利于幼蟹的蛻殼生長，超過一定范圍時表現為抑制作用，幼蟹的最適pH值范圍為8～9。

在不同pH實驗組中，幼蟹成活率以pH 8最高，增重率以pH 9最大，即與pH 7、pH 10相比，實驗組中幼蟹生長效果較好的pH 值為8～9，這跟種植水草的對照組pH值范圍(8.2～9.1)是一致的。但對照組河蟹的生長效果在所有養殖組中最好，這與種植水草的水體能夠提供更優的生存環境有關。種植水草的水體除了調節pH范圍外，還能提供豐富的餌料食物作為河蟹重要的營養源，能有效地遮陽降溫，是蛻殼時支撐和隱蔽的場所，能提供良好的棲息環境[12]。

在調節pH的機制上，水草通過光合作用吸收CO2，改變水體中碳酸鹽平衡，促使總堿度增加，從而提供水體較高pH值[23]。另一方面，水草也能在一定范圍內穩定水體pH。養殖池塘中常產生大量有機物(養殖生物的排泄和尸體、餌料殘渣以及其他生物的代謝、死亡等)，這些物質在一定條件下(如暴雨)，使水體缺氧、變黑發臭，水質惡化，產生有機酸(乳酸和醋酸)，H2S、CO2等酸性物質，改變水體pH，嚴重時使水體酸化(pH<7)[24]。水草能直接吸附部分有機物質，同時也能間接降低水體有機物含量，如水體有機氮被微生物分解與轉化后，無機氮(氨氮)作為水草的營養物質而被水草吸收[25]，從而在一定范圍內維持水體pH穩定。綜上所述，水草能在一定范圍內提供并維持水體pH，即水草能為河蟹的生長發育提供合適的pH水體環境。

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(責任編輯：鄧薇)

收稿日期：2015-09-30；

修訂日期：2015-12-28

第一作者簡介：劉金生(1990-),男,碩士研究生,專業方向為水產動物種質資源與苗種工程。E-mail:876439014@qq.com 通訊作者：王成輝。E-mail:wangch@shou.edu.cn

中圖分類號：S966.12

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)04-0096-05

The effect of pH on the molting,growth and related gene expression in juvenile mitten crab,Eriocheir sinensis

LIU Jin-sheng,WANG Jun,YUE Wu-cheng,CHEN Jiao,HUANG Shu,CI Yuan-ji,WANG Cheng-hui

(KeyLaboratoryofFreshwaterFisheriesGermplasmResoures,MinistryofAgriculture，ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Abstract：In order to investigate the effect of pH on the molting,growth and expression of related genes (MIH,EcR,RXR,IGF2) in juvenile mitten crabs, Eriocheir sinensis,with the average weight of (0.43±0.09)g cultured in the indoor experiment closets,tests were conducted with four experimental group of pH=7,8,9 and 10 (no water grass) and one control group (water grass) for one inter-molting period (37 days).The results indicated that the survival rate and weight gain in the control group were significantly higher than those in the experimental groups,while the lowest survival rate and weight gain existed in the pH 10 group.The quantitative real-time PCR showed there were significant expression difference in MIH, EcR and RXR genes.Among the different water pH groups,however,there was no significant expression difference in IGF2 gene.Correlation analysis showed that there was significant positive correlation between the weight gain rate and survival rate,and among EcR、RXR and IGF2 genes,indicating synergistic effects in expression in the three genes.Combining survival rate,weight gain and gene expression,it would have been concluded that the optimal pH was 8～9 for juvenile crab.

Key words：Eriocheir sinensis;pH;water grass;molting;growth;gene expression

資助項目：上海市科委崇明科技專項項目(13391912102)；上海市工程技術中心建設項目(03DZ2251800);上海市中華絨螯蟹產業技術體系項目[滬農科(產)字2014第4號]