玉米Zmcen基因的克隆、表達與生物信息學分析

雷海英，白鳳麟，劉建霞，王志軍

（1.長治學院生物科學與技術系，山西長治 046011；2.山西大同大學農學與生命科學學院，山西大同 037009；3.長治學院化學系，山西長治 046011）

玉米Zmcen基因的克隆、表達與生物信息學分析

雷海英1，白鳳麟1，劉建霞2，王志軍3

（1.長治學院生物科學與技術系，山西長治 046011；2.山西大同大學農學與生命科學學院，山西大同 037009；3.長治學院化學系，山西長治 046011）

為研究玉米Zmcen基因的特征及生物學功能，并對其編碼蛋白結構與功能進行分析。以玉米cDNA為模板，將其構建到帶有GST表達標簽的原核表達載體pGEX-6p-1中，構建的重組載體pGEX-6p-ZmCen轉化至大腸桿菌BL21（DE3），通過0.3 mmol/L IPTG在27℃下誘導表達20 h，獲得了可溶性的GST融合蛋白。采用GST親和層析柱對重組蛋白進行純化，經12%SDS-PAGE電泳和GST標簽抗體Western Blotting檢測，鑒定為含有GST-Tag的融合蛋白，純化的蛋白經PreScission Protease（PPase）過夜酶切切除GST標簽，得到較純的ZmCen蛋白；同時利用生物信息學的方法，解析ZmCen蛋白質的結構特征。結果表明，該基因定位于玉米第7#染色體上，全長基因含有6個外顯子和7個內含子，519 bp的開放閱讀框，編碼172個氨基酸，分子量約為19.78 kDa，等電點為4.78。采用maizeGDB數據庫對玉米整個生命周期的表達水平進行分析表明，細胞分裂旺盛的部位，Zmcen基因的表達量較高。對16種植物進行系統發育樹分析顯示，Zmcen基因與水稻、小麥、擬南芥等的centrin基因同源性高達80.21%，該結果為探索Zmcen蛋白的未知生物學功能提供了線索。

Zmcen基因克隆；表達；純化；生物信息學

中心蛋白（Centrin，也叫Caltractin）是一個分子量約20 kDa的酸性蛋白，屬于鈣調蛋白超家族的成員，是微管組織中心（Microtubule-organizing centre，MTOC）的組成部分。有研究表明，一個中心蛋白含有4個EF-hand結構域，每個EF-hand結構域都是由一個“α螺旋-loop環-α螺旋”的結構組成，結合一個鈣離子后發生構象變化而發揮其生物學功能［1-5］，迄今為止已經發現有1 000多種蛋白中存在這種結構。中心蛋白最早是在綠藻中發現的［6］，后來在酵母、原生動物、高等植物、哺乳動物等中都有發現［7-11］。目前，較多的研究主要集中在原核生物、人及低等植物的中心蛋白，而對于高等植物中心蛋白的報道比較少。有研究發現，高等植物中由于沒有微管組織中心的結構，只能靠一些含微管蛋白的細胞器來行使類似的功能。其中心蛋白在細胞有絲分裂、紡錘體的分離、纖維的收縮等功能上起重要作用［3］。研究綠藻發現，其中心蛋白定位于細胞的細胞板、細胞核的表面及胞間連絲［12-14］；煙草的中心蛋白主要與微粒體相連，小部分在胞質的多聚蛋白復合物中，它在胞質分裂時參與細胞板的形成，也參與Ca2+在胞內的運輸［15］；對水蕨（Marsilea）的研究發現，其中心蛋白翻譯的中斷影響了精子細胞中的微管分布，它可能控制著細胞骨架和運動型細胞器的形成［16］。而對于玉米ZmCen蛋白（Centrin）的研究，至今未見報道。

本研究克隆并表達了ZmCen蛋白，采用maizeGDB等數據庫資源分析了Zmcen基因結構，并進行了生物信息學的分析，旨在為今后研究ZmCen蛋白的結構與功能、探索玉米中心蛋白影響細胞分裂分化機制的生物學功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用玉米材料為自交系鄭58，BL21（DE3）由長治學院分子生物學實驗室保存；原核表達載體pGEX-6p-1由山西大學分子研究所惠贈；總RNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、反轉錄試劑盒、限制性內切酶、連接酶、凝膠回收試劑盒、小量質粒DNA制備試劑盒等均購自TaKaRa公司；引物合成、樣品測序均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米總RNA的提取 cDNA第一鏈合成根據RT-PCR試劑盒（TaKaRa Reagents）說明，從約2周齡玉米葉片中提取總RNA（TRIzol法）后，采用微量核酸蛋白測定儀NanoDrop-2000（Thermo）檢測RNA濃度后，吸取2μL去除基因組DNA，后反轉錄成cDNA第1鏈。合成的樣品稀釋10倍后儲存于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 Zmcen基因的CDS克隆 根據GenBank中基因登錄號Zea mays caltractin（LOC100284444） mRNA報道的玉米基因的cDNA序列，使用Primer 5.0軟件設計PCR擴增引物，上游引物為m F：5′-GCCGGATCCGGCGATGAGTTTCAACCAGT-3′，下游引物為mR：5′-GCCGTCGACCAGCG TCA AGCACTC ACAGA-3′（劃線部分分別為Bam HⅠ、SalⅠ限制性內切酶酶切位點，下游引物上TCA為終止密碼子）。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃35 s，53℃40 s，72℃3 min，72℃7 min，34個循環。PCR產物用1%瓊脂糖電泳檢測目的基因。

1.2.3 Zmcen基因原核表達載體的構建及誘導表達、純化 將目的基因片段與空載體pGEX-6p-1分別用Bam HⅠ、SalⅠ雙酶切，純化試劑盒回收PCR擴增產物，1%瓊脂糖電泳回收線性載體。T4DNA連接酶于16℃連接過夜后，轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞，挑取陽性克隆后酶切并測序鑒定。

將測序鑒定正確的陽性克隆單菌落接種于2 m L含Amp的LB培養液中過夜培養，再取過夜培養物按1∶100的比例接種于500 m L含Amp的LB培養基中，培養菌液OD值為0.6～0.8時，加入IPTG（終濃度達0.3 mmol/L）誘導表達，27℃振蕩培養20 h后離心收集菌體，菌體用PBS（140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，pH值7.3）緩沖液清洗1次，5 000 r/min離心10 min，向沉淀中加入15 m L PBS緩沖液，均勻吹打重懸菌體，加入PMSF及溶菌酶，冰浴20 m in后，超聲波（頻率為20 kHz，超聲處理3～5 s，間隙3～5 s）破碎至菌懸液呈半澄清狀態。10 000 r/min，4℃離心收集上清。取10μL蛋白樣品中加入等體積的2×SDS上樣緩沖液混勻，100℃煮沸5 min，12%SDS-PAGE電泳檢測。

將表達的GST-ZmCen融合蛋白經GST（Glutathione SepharoseTM4B）親和層析柱后，用PreScission Protease（PPase）以1 mg PPase/60 mg（GST融合蛋白）的比例4℃溫浴過夜酶切。用1×PBS緩沖液洗脫后得到較純的ZmCen蛋白，經12%SDS-PAGE電泳檢測后-80℃凍存備用。

1.2.4 Western Blotting進一步檢測目的蛋白 將純化的融合蛋白經12%SDS-PAGE電泳后，參照分子克隆實驗指南，將SDS-PAGE膠上的蛋白轉移至硝酸纖維素膜，順次進行一抗GST抗體、二抗羊抗鼠Ig抗體標記（北京中杉金橋），TBST（100 mmol/L Tris-HCl，1 500 mmol/L NaCl，20%Tween 20）緩沖液漂洗后放于顯色液（AP Buffer 1 m L，BCIP 3.33 μL，NBT 13.33μL，中杉金橋）中，顯色圖像清晰時，浸入超純水中終止反應。

1.2.5 Zmcen基因及蛋白的生物信息學分析 由測序正確的陽性克隆結果，利用玉米“maizeGDB數據庫”對所克隆基因進行基因組結構、氨基酸的相對分子量、等電點、Zmcen基因在各器官及各個階段的表達水平。采用EBI開源網站的Blast進行比對，用Clustal W對搜索的16種植物同源基因的氨基酸序列進行比對，構建了系統進化樹［17］。

2 結果與分析

2.1 玉米Zm cen cDNA序列的擴增結果

提取的總RNA經RT-PCR擴增后，擴增產物由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到cDNA片段，與試驗要求的Zmcen基因的條帶位置在540 bp（加酶切位點和保護堿基）大小相符，可初步確定這些擴增片段為目的片段（圖1-A）。回收擴增的片段連接并轉化大腸桿菌BL21感受態細胞后，采用Bam HⅠ、SalⅠ進行雙酶切驗證正確（圖1-B），送由上海生工測序驗證，所克隆序列包含一個519 bp的開放閱讀框，編碼 172個氨基酸，無移碼和突變，命名為pGEX-6p-Zmcen。

圖1 Zm cen基因PCR擴增結果（A）和pGEX-6p-Zm cen陽性重組子雙酶切產物（B）Fig.1 PCR am p lification of Zm cen gene and the recom binant p lasm id digested by restriction endonuclease of pGEX-6p-Zm cen p lasm id digested

2.2 Zm Cen蛋白的原核誘導表達結果

將轉化成功的陽性克隆pGEX-6p-Zmcen-BL21菌株，經IPTG誘導表達的蛋白超聲波處理后，12% SDS-PAGE電泳分析（圖2-A），結果表明，在46 kDa處出現大量蛋白表達的條帶，且大部分蛋白存在于上清液中，說明正確表達出GST融合蛋白，為可溶性蛋白。將表達的GST融合蛋白純化并用PPase（PreS-cission Protease）切除GST標簽后，12%SDS-PAGE電泳鑒定為與理論分子量相符的大小片段（圖2-B）。

2.3 W estern Blotting結果分析

對原核表達的GST融合蛋白采用Western Blotting技術進行驗證，結果顯示，條帶為預期的46 kDa大小，圖像清晰，表明成功表達出GST融合蛋白（圖2-C）。

圖2 GST-Zm Cen融合蛋白純化前后的12%PAGE電泳及W estern Blotting結果Fig.2 The resu lts of GST-Zm Cen fusion both before and after pu rified protein（A and B），and GST-Zm Cen p rotein W estern Blotting（C）

2.4 Zm cen基因結構分析

經maizeGDB數據庫搜索，結果顯示，所克隆的Zmcen基因位于玉米第7號染色體的第165 886 707～165 889 303位點處，基因組全長2 596 bp；Zmcen基因經基因組結構分析表明該基因含有6個外顯子，7個內含子。對玉米ZmCen蛋白預測其理論分子量為19.78 kDa，等電點為4.78，顯酸性。生物信息學分析結果表明，玉米ZmCen蛋白有4個EF-hand結構，與鈣調蛋白的結構同源，每一個EF-hand結構結合一個Ca2+，執行鈣信號傳遞的功能（圖3）。

圖3 Zm cen基因在第7#染色體上的定位及其Ca2+結合結構域Fig.3 Zm cen gene location im age on the 7#chrom osom e and its structure dom ain w ith Ca2+

圖4 Zm cen基因在各部分組織表達的預測結果Fig.4 Zm cen gene expression in every part of the organization forecast resu lts

圖5 16種植物centrin基因多序列比對Fig.5 M ultip le sequence alignm ent of 16 p lan ts species based on centrin gene sequences

Zmcen基因在各個器官不同生長階段的表達水平如圖4所示。根據顏色的深淺表示該基因在玉米整個生命周期各器官中的表達水平。從整體來看，玉米中心蛋白基因在根中的表達量較低，其次莖、雄穗、花藥、花粉、種子、幼胚、胚乳逐漸增強。從圖4還可以看出，玉米種子的種皮在授粉后的整個時期中都有表達，而種子在播種萌發24 h后表達水平比較大，當播種3 d后，種子內的表達量很少，同時在胚芽鞘以及初生根的表達水平較高。玉米雌穗的內苞葉和外苞葉的表達水平也較大。由以上表達水平的高低可以看出，處于旺盛生長分裂期的細胞中，Zmcen基因的表達水平均較高，反之，表達量降低，這也充分說明Zmcen基因跟玉米細胞有絲分裂相關的功能相吻合。

EBI數據庫搜索“Centrin”關鍵詞，篩選出了16種植物Centrin的氨基酸一級結構，采用DNAMAN本地軟件序列比對，結果顯示，所選16種植物同源性高達80.21%（圖5）。從構建的系統發育樹可以看出，玉米與水稻的親緣關系最近，它們的蛋白同源性最高，聚為一類，它們與煙草、番茄等幾種植物屬于一個分支；擬南芥卻與胡楊聚為一類，與葡萄、蓖麻等屬于另一個分支（圖6）。Centrin基因在各物種的保守程度極高，以及Centrin在物種中的普遍存在性，從而推斷，Centrin在各物種中存在不可忽視的作用。

圖6 16種植物Cen trin（caltractin）蛋白的系統發育樹Fig.6 Genetic clustering analysis of 16 p lants species based on centrin gene

3 討論

Centrin同鈣調蛋白CaM的功能類似，是一種廣泛存在于生物體中鈣結合蛋白［18］，Centrin是一種酸性鈣結合蛋白，在綠藻中主要參與細胞周期中基體的復制、分離、正確定位以及鞭毛的切除［19-20］。有研究報道，中心蛋白基因的4個EF-hand結構都含有共同的氨基酸序列，即DxDxDG［21］的模體，作為Ca2+的結合位點，中心蛋白結合鈣離子后，構象會發生很大的變化，從“關閉式”狀態變為“敞開式”，同時也伴隨著大量疏水基團的暴露，形成了一個疏水腔，推測可能是目標蛋白的結合位點［3，22］。4個EF-hand結構分別位于蛋白的N末端、C末端結構域各2個。從氨基酸的序列分析，得知中心蛋白N-末端屬于高變區，C-末端屬于高度保守區［23］。綠藻的中心蛋白N末端和C末端發揮不同的功能，有不同的靶蛋白。N末端負責鈣離子信號的傳導，C末端則負責下游目標蛋白的結合［24-26］。在不同物種中，Ca2+的結合位點DxDxDG序列的高度保守性，暗示著中心蛋白執行著不可忽視的功能，以及天冬氨酸（D）作為Ca2+結合位點的意義重大。在擬南芥中已克隆到Atcen。有報道表明，擬南芥AtCen2存在于核中，參與核酸的切除修復［27］，Centrin或相關蛋白控制有絲分裂及紡錘絲的形成以及在物種中的高度同源，可推測中心蛋白基因在植物生長發育中的重要性。也有文獻報道，該基因負責有絲分裂紡錘絲形成相關蛋白［28］。而對于Zmcen的研究目前尚未見報道。在本研究中克隆并表達了Zmcen蛋白，今后擬對玉米Zmcen基因調控細胞分裂分化機制、DxDxDG序列各位點的功能、ZmCen蛋白在玉米中的調控網絡等生物學功能進行進一步研究。

［1］ Schiebel E，Bornens M.In search of function for centrins［J］.Trends Cell Biol，1995，5：197-201.

［2］ Hu H，Sheehan J H，Chazin W J.The mode of action of centrin：binding of Ca2+and a peptide fragment of Kar1p to the C-term inal domain［J］.J Biol Chem，2004，279（49）：50895-50903.

［3］ Dantas T J，Wang Y F，Lalor P，et al.Defective nucleotide excision repair with normal centrosome structures and functions in the absence of all vertebrate centrins［J］. Journal of Cell Biology，2011，193（2）：307-318.

［4］ Avasthi P，Scheel J F，Ying G A，et al.Germ line deletion of Cetn1 causes infertility in male mice［J］.Journal of Cell Science，2013，126（14）：3204-3213.

［5］ Camargo A I，W iggers H J，Damalio JC，et al.Structural and thermodynamic studies of two centrin isoforms from Blastocladiella emersonii upon Calcium binding［J］.Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics，2013，1834（12）：2823-2831.

［6］ Salisbury JL，Baron A T，Sanders M A.The centrin-based cytoskeleton of Chlamydomonas reinhardtii：distribution in interphase and mitotic cells［J］.J Cell Bio，1988，107：635-641.

［7］ Jerka-Dziadosz M，Koll F，W loga D，et al.A centrin3-dependent，transient，appendage of the mother basal body guides the positioning of the daughter basal body in paramecium［J］.Protist，2013，164（3）：352-368.

［8］ Ying G，Avasthi P，Irwin M，et al.Centrin 2 is required for mouse olfactory ciliary trafficking and development of ependymal cilia planar polarity［J］.The Journal of Neuroscience，2014，34（18）：6377-6388.

［9］ Asteriti IA，Giubettini M，Lavia P，et al.Aurora-A inacti-vation causesmitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces［J］.Molecular Cancer，2011，10：131.

［10］ Grecu D，Assairi L.CK2 phosphorylation of human centrins 1 and 2 regulates their binding to the DNA repair protein XPC，the centrosomal protein Sfi1 and the phototransduction protein transducin beta［J］.FEBS Open bio，2014，4（4）：407-419.

［11］ Delaval B，Covassin L，Lawson N D.Centrin depletion causes cyst formation and other ciliopathy-related phenotypes in zebrafish［J］.Cell Cycle，2011，10（22）：3964-3972.

［12］ Del Vecchio A J，Harper JD I，Vaughn K C，et al.Centrin homologues in higher plants are prom inently associated with the developing cell plates［J］.Protoplasma，1997，196：224-234.

［13］ Wick S，Cho S O.Higher plant spindle poles contain a protein that react with antibodies to the calcium-binding protein centrin［J］.JCell Biol，1988，107：455.

［14］ Leila M Blackman，John D I Harper，Robyn L.Overall localization of a centrin-like protein to higher plant plasmodesmata［J］.European Journal of Cell Biology，1999，78：297-304.

［15］ Stoppin-Mellet V，Canaday J，Lambert A M.Characterization of microsome-associated tobacco BY-2 centrins［J］.Eur JCell Biol，1999，78（11）：842-848.

［16］ Klink V P，Wolniak SM.Centrin is necessary for the formation of the motile apparatus in spermatids ofmarsilea［J］.Mol Biol Cell，2001，12（3）：761-776.

［17］ 王步勇，王 峰，李丹蕾，等.水稻干尖線蟲氨基肽酶基因克隆及功能初步分析［J］.華北農學報，2015，30（4）：1-7.

［18］ 袁 俊，李朝軍.鈣調蛋白在PC12細胞分化和遷移中的作用［J］.華北農學報，2011，26（1）：22-25.

［19］ Liu A K，Wang Y，Dang C W，et al.A genome-wide identification and analysis of the basic helix-loop-helix transcription factors in the ponerine ant，Harpegnathos saltator［J］.BMC Evolutionary Biology，2012，12：165.

［20］ Yang C H，Kasbek C，Majumder S，et al.Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly［J］.Molecular Biology of the Cell，2010，21（24）：4361-4372.

［21］ Daniel JRigden，M ichael Y Galperin.The DxDxDG motif for calcium binding：Multiple structural contexts and imp lications for evolution［J］.JMol Biol，2004，343：971-984.

［22］ Sawant D B，Majumder S，Perkins JL，et al.Centrin 3 is an inhibitor of centrosomal Mps1 and antagonizes centrin 2 function［J］.Molecular Biology of the Cell，2015，26（21）：3741-3753.

［23］ Daunderer C，Schliwa M，Gr F R.Dictyostelium centrinrelated protein（DdCrp），the most divergent member of the centrin family，possesses only two EF hands and dissociates from the centrosome during mitosis［J］.Eur J Cell Biol，2001，80（10）：621-630.

［24］ Veeraraghavan S，Fagan P A，Hu H，et al.Structural independence of the two EF-hand domains of caltractin［J］.JBio Chem，2002，277（32）：28564-28571.

［25］ Kim S，Rhee K.Importance of the CEP215-Pericentrin interaction for centrosome maturation during m itosis［J］.PLoSOne，2014，9（1）：e87016.

［26］ Ivanovska I，Rose M D.Fine structure analysis of the yeast centrin，Cdc31p，identifies residues specific for cellmorphology and spindle pole body dup lication［J］. Genetics，2001，157：503-518.

［27］ Liang L，Flury S，Kalck V，et al.Centrin2 interacts with the Arabidopsis homolog of the human XPC protein（At-RAD4）and contributes to efficient synthesis dependent repair of bulky DNA lesions［J］.Plant Molecular Biology，2006，61（1/2）：345-356.

［28］ Alexandrov N N，Brover V V，Freidin S，et al.Insights into corn genes derived from large-scale cDNA sequencing［J］.Plant Mol Biol，2009，69（1/2）：179-194.

Cloning，Expression and Bioinform atics Analysis of M aize Zm cen Gene

LEIHaiying1，BAIFenglin1，LIU Jianxia2，WANG Zhijun3
（1.Department of Biology Science&Technology，Changzhi University，Changzhi 046011，China；2.College of Agronomy&Life Sciences，Shanxi Datong University，Datong 037009，China；3.Department of Chemistry，Changzhi University，Changzhi 046011，China）

To study the characteristics and biological function of Zmcen gene，investigate the protein structure of Zea mays L.，the ORF ofmaize Zmcen gene was cloned into the expression vector pGEX-6p-1 through PCR method，and the GST recombined expression vector pGEX-6p-Zmcen was constructed.Recombinant GST-ZmCen fusion protein was expressed as soluble protein in Escherichia coli BL21（DE3）after induction with 0.3 mmol/L IPTG at 27℃for 20 h.The ZmCen protein with the GST affinity chromatography and verified the protein by 12%SDSPAGE and Western Blotting with anti-GST antibody were purified.Fusion protein was cut out the GST-Tag by PPase and was purified.And by the method of biological information，the results showed that the Zmcen gene was located on the 7#chromosome，and the full-length gene had 6 exons and 7 introns.The ZmCen protein domain search and alignment analysis were conducted by themaizeGDB resources，and the ZmCen was EF-hand domain fam ily protein. The CDS region of Zmcen gene was 519 bp，encoding 172 am ino acid with a molecular weight of 19.78 kDa and p I of 4.78.Using maizeGDB database searching，the expression level analysis showed that Zmcen gene expression had a higher level in cells divided vigorous of the entire maize life cycle.The evolutionary history of centrins was analyzed by means of phylogenetic analysis in plants.The centrin gene was a highly 80.21%homology among centrins of 16 different p lants.The results of the research can provide a theoretical basis for exploring the unknown biologicalfunction of ZmCen protein.

Zmcen gene cloning；Expression；Purification；Bioinformatics

S512；Q71；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：1000-7091（2016）03-0018-07

10.7668/hbnxb.2016.03.003

2016-01-08

國家自然科學基金項目（21201024）；山西省自然科學基金項目（2012021009-1）；山西省科技攻關項目（20140311005-3）

雷海英（1978-），女，山西平遙人，講師，碩士，主要從事分子生物學教學與研究。

王志軍（1980-），男，山西原平人，教授，博士，主要從事生物無機化學的教學與研究。