蘋果MdSBP20基因抗非生物脅迫的研究

沙 婷，侯鴻敏，孟祥娜，柏素花，周愛琴，沙廣利，戴洪義，祝 軍

（1.青島農業大學園藝學院，山東青島 266109；2.青島市農業科學研究院，山東青島 266100）

蘋果MdSBP20基因抗非生物脅迫的研究

沙 婷1，侯鴻敏1，孟祥娜1，柏素花1，周愛琴1，沙廣利2，戴洪義1，祝 軍1

（1.青島農業大學園藝學院，山東青島 266109；2.青島市農業科學研究院，山東青島 266100）

為獲得蘋果砧木逆境脅迫相關轉錄因子，以QZ1（平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd.）×柱型蘋果株系CO（Malus domestica Borkh.）和M26為試材，利用同源克隆法克隆得到蘋果SBP基因cDNA的全長序列，命名為MdSBP20。對擴增得到的cDNA序列進行生物信息學分析，結果表明，該序列全長1 362 bp，包含完整開放閱讀框1 362 bp，編碼454個氨基酸，具有明顯的SBP結構域，包含2個鋅指結構Zn-1、Zn-2和雙向核定位信號區NLS。系統進化樹分析，結果表明MdSBP20與白梨（XM_009339726.1）和蘋果（XM_008376435.1）親緣關系較近。實時熒光定量分析結果表明，MdSBP20基因在低溫、干旱、鹽害中發揮一定功能，推測QZ1的耐寒性、耐旱性及耐鹽性均強于M 26。研究表明，MdSBP20基因在蘋果響應非生物逆境脅迫中具有重要調控作用。

蘋果；非生物脅迫；MdSBP20基因；基因克隆；表達分析

蘋果（Malus domestica Borkh.）是我國栽培面積和產量較大的重要果樹，蘋果樹在整個生長發育過程中，經常遭遇各種不利環境的影響，如寒害、干旱、鹽害、洪澇、礦物質缺乏等非生物脅迫因素，致使其減產，甚至死亡，從而造成經濟損失。長期以來，人們主要通過傳統的雜交育種手段來保持并改良蘋果抗性性狀，但蘋果生長周期長、遺傳雜合程度高、自交不親和等特點給育種工作帶來許多困難。近年來果樹轉基因技術的發展，特別是蘋果全基因組測序的成功為加快蘋果抗性育種進程提供了新的可能。

已有相關報道表明，在植物體遭受到低溫、干旱、高鹽等逆境脅迫時，轉錄因子可以調控相關基因的表達，在抗逆應答中發揮重要作用［1］。許多植物中的WRKY、bZip和MYB等轉錄因子都能夠響應干旱、鹽堿、低溫等逆境脅迫，提高植物對非生物脅迫的耐受力［2-4］。SBP基因（Squamosa promoter binding protein，SBP）是綠色植物特有的一類轉錄因子，最早從金魚草（Antirrhinum majus）中分離得到，因其能夠識別并調控花發育基因的Squamosa啟動子結合蛋白，故命名為SBP基因［5］。該基因有很多重要的生物學功能，已陸續從擬南芥［6］、白樺樹［7］、衣藻［8］、苔蘚［9］、番茄［10］、水稻［11］和蘋果［1］中分離。在前期對該基因的研究主要集中在花發育方面，但最近有研究表明，SBP-box基因可以通過參與防御反應的基因相互作用對各類生物和非生物脅迫做出響應［12］。伏馬毒素B1（Fumonisin B1）是一種可以誘導植物細胞程序性死亡的真菌類毒素。研究發現AtSPL14基因參與了該細胞程序性死亡，且在伏馬毒素B1的敏感性方面有重要作用［13］。AtSPL7可以通過miR397、miR408和mir857來下調相關銅蛋白的表達水平。在銅缺乏條件下，AtSPL7還可以通過銅離子重新分配來彌補銅素缺乏進而調節植物體內的銅平衡［14］。此外，衣藻中的SBP基因Cu response regulatorⅠ（CrrⅠ）也有類似的作用［8］。SBP基因是m ir156的靶基因，而m icRNA可以通過調節靶蛋白編碼基因的表達來實現其在植物中的各種生物學功能。許多不同物種中的研究表明，miR156對高溫［15］、低溫［16-17］、鹽［18-20］、干旱［19-20］、紫外輻射［21］、低氧［18］等非生物脅迫均有響應。

本試驗克隆了抗逆相關基因MdSBP20，并研究在各種非生物脅迫下，不同砧木中該基因的表達模式，旨在初步探索MdSBP20基因在蘋果抗非生物脅迫方面的功能，為進一步深入研究SBP家族基因在蘋果抗逆反應過程中的機理提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試材選用的QZ1和M26組培苗由青島市農業科學研究院提供。分別將在MS+0.5 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3（MNG）中培養20 d的QZ1和M26健康植株轉接至MNG培養基、MNG+低溫（4℃）處理、MNG+400 mm/L甘露醇、MNG+ 150 mm/L NaCl的培養基中，模擬干旱和鹽堿處理。分別于處理3，6，12，24，48，96，120，168 h時取其全株，對照為處理3 h的樣品，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存，用于植物總RNA的提取。本試驗于青島農業大學園藝學院完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉錄 采用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（原平晧生物技術有限公司）提取QZ1、M26植株的總RNA。并用紫外分光光度計法（NanoDrop）和瓊脂糖凝膠電泳法（1.0%）檢測所提取RNA的純度、濃度和完整性。采用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒反轉錄。

1.2.2 蘋果MdSBP20基因cDNA全長的克隆 參照蘋果全基因組數據庫［22］及前人的研究結果［1］，選用Premier5.0設計特異引物MdSBP20-F和MdSBP20-R（表1）。以2種蘋果砧木cDNA第一鏈為模板擴增MdSBP20基因cDNA全長，其反應體系20μL，其中cDNA模板1.0μL，Dream TaqTMGreen PCR Master Mix（2×）10.0μL、上下游引物MdSBP20-F和MdSBP20-R各0.8μL、ddH2O 7.4 μL。擴增的反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環；72℃延伸10 m in。凝膠電泳檢測并回收目的片段（北京天根生物工程有限公司的膠回收試劑盒），先連接到pGEM-Teasy載體（Promega Madison.W I. USA）后轉化DH5α。經藍白斑篩選，PCR鑒定后送交生工生物工程（上海）技術服務有限公司測序，使用軟件DNAMAN檢驗其測序準確性。

1.2.3 蘋果MdSBP20基因序列的生物信息學分析應用DNAMAN6.0進行MdSBP20 cDNA全長序列拼接，利用美國國立生物技術信息中心（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/）網站進行該基因ORF（Open reading frame）的確定、保守結構域的分析，檢索近緣物種的SBP序列信息；通過MEGA軟件進行系統進化樹和蛋白多重序列比對分析；使用Prot-Param tool（http：//web.expasy.org/proteom ics/）對蛋白質的理化性質進行分析（包括氨基酸組成、分子量、等電點等）。

表1 蘋果M dSBP20基因的克隆及表達分析所用的引物Tab.1 Prim ers used to isolate and analyze the exp ression of M dSBP20 in M alus

圖1 M dSBP20基因的PCR擴增結果Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of M dSBP20 gene fragm en ts

圖2 M dSBP20的全長cDNA序列以及推導的氨基酸序列Fig.2 The full-length cDNA sequence of M dSBP20 and its am ino acid sequence

1.2.4 MdSBP20的RT-PCR分析 利用實時熒光定量PCR技術分析蘋果MdSBP20基因的表達量。用PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time（TaKaRa）試劑盒將繼代培養20 d健康的QZ1、M26植株（6，12，24，48，96，120，168 h）各個時間點兒的總RNA反轉錄合成cDNA備用。根據實時熒光定量PCR引物設計的原則分別設計內參引物Actin RT-F、Actin RT-R及特異引物MdSBP20RT-F和MdSBP20RT-R（表1）。試驗參照SYBR Premix ExTaqTMⅡ（Perfect Real Time）（TaKaRa）試劑盒的說明書在Roche LightCycler 480Ⅱ實時定量PCR儀上完成。按照TaKaRa生物公司的SYBR-Green試劑盒說明書進行操作，配置20μL反應體系：SYBR prem ix 10μL，cDNA 1.0μL（取1μg RNA合成第1鏈cDNA，然后將cDNA模板稀釋5倍），上下游引物（10.0μmol/L）各0.8μL，Sterile Water 7.4μL。擴增程序如下：95℃預變性10 min；95℃10 s，60℃30 s，72℃10 s延伸，進行45個循環。在此過程中連續檢測其熒光值繪制溶解曲線；采用2-ΔΔCT方法［23］分析數據；利用Excel進行繪圖，并使用SPSS進行單因素方差分析及Duncan檢測；每個時間點進行3次生物學重復和3次技術重復。

2 結果與分析

2.1 MdSBP20基因cDNA的全長序列克隆和序列分析

以QZ1、M26植株基因組cDNA為模板，選用特異引物MdSBP20-F和MdSBP20-R作為上下游引物進行PCR擴增，得到與MdSBP20目的片段大小一致的約1 300 bp的條帶（圖1）。經切膠回收后與pGEM-Teasy載體連接轉化DH5α并進行測序。結果表明，2條cDNA片段大小均為1 362 bp，與基因組DNA序列完全一致。Blast比對分析表明，結果與根據蘋果全基因組數據庫預測的序列結果吻合，因此，確認獲得正確的核苷酸序列。使用NCBI搜索MdSBP20的ORF，最大為1 362 bp，編碼454個氨基酸，預測其蛋白質分子量為49.372 32 kDa，等電點為8.597，且分析表明，SBP基因含有一個完整的SBP-domain結構域（PF03110），經序列比對分析發現這2個基因與蘋果基因組數據庫中蘋果金冠的基因序列一致（圖2）。

2.2 M dSBP20基因的同源性及進化分析

以MdSBP20基因序列為模板，通過NCBI Blast獲得與其序列相似度較高的其他物種SBP基因序列并進行進化樹和多重比較分析。進化樹分析結果表明，該基因與白梨PbSBP6、蘋果MdSBP6、番茄SlySBP6a、SlySBP6c親緣關系較近，其中與白梨的遺傳距離最近（圖3）。對搜索獲得的所有SBP基因結構域多重比較分析發現，MdSBP20基因與其他已知基因序列類似，也含有一個完整的SBP-domain結構域（PF03110），其中包含2個鋅指蛋白結構Zn-1、Zn-2和一個雙向核定位信號區NLS（Nuclear location signal）；第2個鋅指結構與核定位信號是部分重疊的，第1個鋅指結構的類型是CysCysHisCys，第2個鋅指結構的類型是CysCysCysHis（圖4），表明MdSBP20是蘋果SBP家族基因中的一員且SBP結構域在植物進化過程中保守程度較高。

圖3 M dSBP與其他植物的系統進化樹分析Fig.3 Phy logenetic tree of M dSBP and the other p lan ts

2.3 M dSBP20基因非生物脅迫的表達分析

2.3.1 低溫脅迫中的表達 本試驗分析了QZ1、M26在低溫脅迫4℃處理后MdSBP20基因的表達特性（圖5）。結果表明：低溫脅迫處理QZ1、M26在各個時間點均能檢測到MdSBP20基因的表達，但兩者在表達模式上存在一定差異（圖5），QZ1中，伴隨低溫脅迫時間不斷延長，MdSBP20基因的表達量呈穩定上升趨勢，120 h表達量達到最高，是對照0 h的13倍（圖5-A）；M26中，MdSBP20基因在短期冷脅迫中被迅速激活，處理6 h時表達量達到峰值，是對照0 h的5.4倍，隨后開始降低，48 h表達量達到最低。隨著脅迫時間的延長，該基因的表達量在96 h時達到第2個峰值（圖5-B）。總的來說，低溫脅迫處理后，MdSBP20基因在QZ1中表達增加倍數要明顯高于M26，表明QZ1的抗低溫（4℃）的能力可能要比M26強。

2.3.2 干旱脅迫中的表達 本試驗分析了QZ1、M26中MdSBP20基因在對干旱脅迫的響應（圖6），分析結果如下：MdSBP20基因在QZ1中有較強的響應。12 h時表達被迅速激活，48 h時表達量達到最高，是對照0 h的4.1倍（圖6-A），之后一直有較高水平的表達；而M26中表達量變化不明顯（圖6-B）。也初步說明MdSBP20基因參與了蘋果砧木中的抗旱反應，且QZ1可能比M26的抗旱能力強。

圖4 蘋果M dSBP20基因和所選物種中SBP基因保守結構域分析Fig.4 Analysis of the SBP dom ain in M dSBP20 and the selected SBP gene from p lant species

圖5 M dSBP20基因在QZ1和M 26低溫脅迫處理不同時間點的表達Fig.5 Exp ression of M dSBP20 gene from QZ1 and M 26 after treatm en t of low tem perature

圖6 M dSBP20基因在QZ1和M 26干旱脅迫處理不同時間點的表達Fig.6 Exp ression of M dSBP20 gene from QZ1 and M 26 after treatm ent of d rought stress

2.3.3 鹽脅迫中的表達 本試驗分析了MdSBP20基因對QZ1和M26鹽脅迫的時空表達（圖7）。結果表明MdSBP20基因在QZ1和M26中均上調表達。QZ1處理12 h時，該基因被迅速激活并達到峰值后，是對照的5.6倍。伴隨脅迫時間延長，各時間點基因表達量降低但一直高于對照水平（圖7-A）；M26中，MdSBP20基因在6，12 h出現短暫的下調表達后表達量開始逐漸升高并于96 h達到峰值，是對照0 h的3.4倍（圖7-B）。說明MdSBP20基因可能參與了蘋果砧木的抗鹽堿反應，且QZ1比M26的抗鹽堿能力強。

圖7 M dSBP20基因在QZ1和M 26鹽脅迫處理不同時間點的表達Fig.7 Expression of M dSBP20 gene from QZ1 and M 26 after treatm ent of salt stress

3 討論

植物抗逆是指植物抵抗干旱、水澇、低溫、高溫、鹽堿、病蟲害等不良環境的能力。逆境包括物理、化學、生物因素等，可分為生物脅迫和非生物脅迫兩大類。其中非生物脅迫中的干旱、低溫、鹽堿等因素是造成我國北方地區蘋果大量減產和嚴重經濟損失的重要原因。

已有相關報道指出，許多轉錄因子（WRKY、bZ-ip、MYB等）都能響應干旱、低溫、鹽堿脅迫，從而提高植物對非生物脅迫的耐受力［2-4］。SBP轉錄因子是近幾年發現的一類植物特有的轉錄因子，在植物的整個生長發育階段都起著重要的作用。本試驗利用同源克隆法，克隆得到的MdSBP20，有典型的SBP保守結構域，包含2個鋅離子結合位點（Cys-Cys-His-Cys和Cys-Cys-Cys-Hi）和保守的核定位信號（NLS），可以確定為SBP家族基因。目前關于SBP基因的功能研究主要集中在花發育領域，但隨著研究的進一步深入，已有研究者指出這類轉錄因子在植物抗逆方面也有重要的功能。

相關報道指出，SBP基因是microRNA156（mir156）的靶基因，蘋果基因組中也已鑒定了27個SBP家族基因，其中15個為mir156的靶基因［1］。本試驗中，克隆得到的MdSBP20基因也包含mir156結合位點。試驗研究表明mir156可以與SBP基因相互抑制，共同調節植物對高溫［15］、低溫［16-17］、鹽堿［18-20］、干旱［19-20］、紫外輻射［21］、低氧［18］等非生物脅迫。在擬南芥遭受高溫脅迫后，mir156基因上調表達［16］，同時m ir156對冷脅迫和紫外輻射脅迫亦有響應［21］。研究者對Osmir156k轉基因水稻及野生水稻幼苗冷脅迫（4℃）研究發現，處理48 h后過表達Osmir156k的轉基因植株變得萎蔫，葉片卷曲，停止生長甚至死亡，而野生型植株生長良好；恢復正常條件培養14 d后，83%野生型植株存活，轉基因植株Osm ir156k-1和Osm ir156k-3幸存的分別只有40%和30%，且轉基因水稻嫩枝和根系比野生型植株短小；進一步對其靶基因SPL3、SPL14和SPL17基因在冷脅迫處理后表達量的變化表明，在野生型基因中的表達量高于Osmir156k轉基因植株，這些結果表明Osmir156k過量表達抑制了轉基因植株中靶基因SPL的表達從而降低了轉基因植株對冷脅迫的抗性［16］。本試驗中蘋果MdSBP20基因在QZ1和M26中經低溫（4℃）處理后表達模式不同，在QZ1中，MdSBP20基因的表達量呈穩定上升趨勢，120 h表達量達到最高，是對照0 h的13倍；在M26中，處理6 h時表達量達到峰值，是對照0 h的4.5倍，隨后開始降低，48 h表達量達到最低。這個結果從另一方面說明QZ1對低溫脅迫（4℃）的耐受力可能要比M26強。在煙草中過量表達水稻OsSPL1基因，隨著鹽濃度的增大，轉基因煙草離體葉片中的葉綠素含量低于野生型煙草離體葉片中葉綠素的含量，降低了植物對鹽脅迫的抗性［18］；低鹽濃度處理陸地棉時，葉片中SPL2基因的表達量上調，隨著鹽濃度升高該基因表達量下降。PEG（Polyethylene p lycol）是親水性大分子，具有很強的吸水性，可以使植物失水，造成干旱脅迫。在陸地棉葉片中，GhSPL2的表達量與PEG濃度有關，PEG濃度為2.5%時，該基因表現為下調，在低于或高于該濃度時，GhSPL2基因的表達量均被上調［20］。干旱脅迫16 d后，葡萄中VvSBP5、VvSBP6、VvSBP7和VvSBP17基因表達量受干旱脅迫影響均表現為上調表達［19］。在本試驗中，MdSBP20基因在QZ1干旱處理后表達量也表現為顯著上調，與前人研究結果類似。可以推測MdSBP20基因可能在蘋果砧木抗非生物脅迫方面發揮一定的功能。

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Study on Abiotic Stress of M dSBP20 Gene from Malus

SHA Ting1，HOU Hongmin1，MENG Xiangna1，BAISuhua1，ZHOU Aiqin1，SHA Guangli2，DAIHongyi1，ZHU Jun1
（1.College of Horticulture，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Qingdao Academy of Agricultural Sciences，Qingdao 266100，China）

To obtain the transcription factor related to stress conditions in apple rootstock，an apple SBP gene with the full-length cDNA was cloned in Qingzhen 1（apomictic crabapple Pingyitiancha（Malus hupehensis Rehd.）× columnar apple strain CO（Malus×domestica Borkh.）and M26 via homology-based cloning method.The gene cloned was named as MdSBP20.Bioinformatics analysis to the cDNA showed that the full-length cDNA was 1 362 bp，it′s open reading frame possessed 1 362 bp，and encoded 454 amino acids，which had obviously SBP-domain and two zinc finger structures（Zn-1，Zn-2）and the bothway nuclear location signal（NLS）.Phylogenetic analysis suggested that MdSBP20 gene had the closer relationship with Pyrus bretschneideri（XM_009339726.1）and Malus domestica（XM_008376435.1）.Real-time PCR analysis showed that MdSBP20 gene p layed a role in response to low temperature，drought，and salt tolerance.Itwas inferred that QZ1 might has higher resistance than M26 nomatter in stress of low temperature，drought，and salt.Based on the results in this experiment，MdSBP20 gene had the significantly effects in apple rootstock response to abiotic stress.

Apple（Malus）；Abiotic stress；MdSBP20 gene；Gene clone；Expression analysis

Q78；S661.1 文獻標識碼：A 文章編號：1000-7091（2016）03-0051-07

10.7668/hbnxb.2016.03.008

2016-03-06

國家蘋果產業技術體系項目（CARS280107）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD02B01-2）；中央財政農業技術推廣項目；山東省良種工程項目；山東省優秀中青年科學家獎勵基金項目（BS2014SW 027）；青島市科技計劃項目（14-2-3-38-nsh）；青島農業大學高層次人才科研基金項目（663/1114338）

沙 婷（1988-），女，內蒙古牙克石人，碩士，主要從事果樹分子生物學研究。

祝 軍（1962-），男，山東諸城人，教授，博士，主要從事果樹生物技術研究。