蓖麻標雌/單雌/兩性系花序MSAP反應體系的建立

趙 永，朱國立，何智彪，包春光，4，陳曉鳳，姜桐桐，李佳會，黃鳳蘭，3，5，周婷婷，常旭豐，劉佳琪

（1.內蒙古民族大學生命科學學院，內蒙古通遼 028000；2.通遼市農業科學研究院，內蒙古通遼 028000；

3.內蒙古高校蓖麻產業工程技術研究中心，內蒙古通遼 028000；4.通遼市農畜產品質量安全中心，內蒙古通遼 028000；5.內蒙古蓖麻育種重點實驗室，內蒙古通遼 028000）

蓖麻標雌/單雌/兩性系花序MSAP反應體系的建立

趙 永1，朱國立2，3，5，何智彪2，包春光1，4，陳曉鳳1，姜桐桐1，李佳會1，黃鳳蘭1，3，5，周婷婷1，常旭豐1，劉佳琪1

（1.內蒙古民族大學生命科學學院，內蒙古通遼 028000；2.通遼市農業科學研究院，內蒙古通遼 028000；

3.內蒙古高校蓖麻產業工程技術研究中心，內蒙古通遼 028000；4.通遼市農畜產品質量安全中心，內蒙古通遼 028000；5.內蒙古蓖麻育種重點實驗室，內蒙古通遼 028000）

為了建立Lm型雌性系蓖麻不同發育時期的標雌/單雌/兩性系花序MSAP反應體系，提取不同類型不同發育時期的花序基因組DNA，混合成基因池；用Eco RⅠ和HpaⅡ/MspⅠ的組合，12 h可將DNA酶切完全；16℃條件下，將酶切產物與Eco RⅠ、HpaⅡ/MspⅠ接頭過夜連接；連接產物用于預擴增。優化后的預擴增反應體系為10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.5μL、Mg2+（25 mmol/L）2.0μL、模板2.0μL、E0擴增引物（10 pmol/μL）1.5μL、H0擴增引物（10 pmol/μL）1.5μL、LA Taq（5 U/μL）0.25μL、ddH2O 12.75μL。預擴增產物稀釋10倍后用于選擇性擴增。優化后的選擇性擴增體系為10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.0μL、Mg2+（25 mmol/L）4.0μL、模板3.0μL、EX擴增引物（10 pmol/μL）1.0μL、H/MX擴增引物（10 pmol/μL）1.0μL、LA Taq（5 U/μL）0.30μL、ddH2O 11.2μL。

蓖麻；花序；MSAP

蓖麻（Ricinus communis L.）是重要的工業油料作物之一［1-2］。蓖麻油是唯一可以替代石油在生產生活中廣泛應用的植物油［3-6］。中國是蓖麻第二大生產國。現階段中國蓖麻產業發展面臨一個極其突出的矛盾，即種子供不應求但收購價格偏低。提高蓖麻單產水平，是解決這一矛盾的有效措施之一。因此，高產仍然是蓖麻育種的首要目標。但是，蓖麻育種還未實現三系配套［7］，主要育種方法有“擬三系配套”和 “一系兩用”“兩系法”，后者使我國蓖麻雜優利用的大面積制種技術問題基本得到解決，目前通遼市農業科學研究院主要采用這種育種方法，Lm型雌性系是該方法育種的基礎材料。Lm型雌性系蓖麻同時包含標雌、單雌和兩性系3種花序類型。國內雖有對蓖麻花序特征及花芽分化的研究，但是對標雌、單雌和兩性系花序發育的基因水平差異研究尚未見報道。

DNA甲基化可以稱作是細胞記憶的一種機制，5′胞嘧啶甲基化是真核生物DNA甲基化的主要形式［8］，這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列，由于甲基化的DNA不容易被轉錄，因此DNA甲基化被認為在發育的時序上限制獲得可轉錄基因［9］。甲基化能引起生物染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達［10-13］。DNA甲基化參與抗逆基因表達調控［14］。其中，MSAP（DNA甲基化敏感擴增多態性）由于其簡便性與通用性成為DNA甲基化水平較為常用的檢測方法［15］。由于DNA甲基化是基因組DNA在轉錄水平上進行調控的一種自然修飾方式，在高等植物中廣泛存在，所以MSAP技術被逐漸應用于植物的DNA甲基化檢測［16-17］。

因此，本試驗的目的是以Lm型雌性系蓖麻在營養生長期（4片真葉期）、營養生長到生殖生長轉變期（5片真葉期）、主莖穗開花期、二級分枝開花期的標雌、單雌、兩性系花序為研究對象［18］，建立其MSAP反應體系，為確定不同類型不同發育時期的花序差異表達基因研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

植物材料：Lm型雌性系蓖麻aLmAB2在營養生長期（4片真葉期）、營養生長到生殖生長轉變期（5片真葉期）、主莖穗開花期、二級分枝開花期的標雌、單雌、兩性系花序，共12個樣品，由通遼市農業科學研究院蓖麻研究室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取及測定 提取12個花序樣品的基因組DNA。提取過程參照莊盟生物植物基因組DNA小量提取試劑盒說明，并用核酸分析儀分別測定260，280 nm時的吸光度。

1.2.2 DNA的雙酶切及與接頭連接 將12個樣品的基因組DNA按等濃度混合成基因池。以低頻限制性內切酶Eco RⅠ和一組同裂酶HpaⅡ/MspⅠ對基因組DNA進行雙酶切，酶切體系如下：DNA 10μL，Cut SmartTMBuffer 3μL，10×Eco RⅠBuffer 3μL，Eco RⅠ1μL，HpaⅡ/MspⅠ1μL，ddH2O 12μL。將酶切混合物置于37℃水浴鍋中12 h，酶切結束后65℃5 min滅活。瓊脂糖電泳檢測后，-40℃冰箱中凍存。

將酶切產物稀釋2倍后與Eco RⅠ接頭和HpaⅡ/ MspⅠ接頭進行連接。將連接體系混合后16℃連接12 h。連接體系如下：DNA酶切產物30μL，Eco RⅠ接頭1μL，HpaⅡ/MspⅠ接頭1μL，10×T4Ligase Buffer 1μL，T4Ligase 1μL，ddH2O 30μL。

1.2.3 預擴增 25μL反應體系中分別加入10× PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）、Mg2+（25 mmol/L）、模板、引物（10 pmol/μL）、Taq（5 U/m L），連接產物作為反應體系模板稀釋5，10，15，20，25倍后進行PCR預擴增，預擴增引物E0：5′-GACTGCG TACCAATTC-3′；H/M0：5′-ATCATGAGTCCTGCTCG G-3。反應體系的設置見表1。反應程序：94℃4 m in；94℃30 s，56℃1 m in，72℃1 m in，30個循環；72℃6 m in；16℃保存。擴增產物用1%的瓊脂糖電泳檢測。

1.2.4 選擇性擴增 選擇性擴增引物序列見表2。25μL反應體系中分別加入10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）、Mg2+（25 mmol/L）、模板、引物（10 pmol/μL）、Taq（5 U/m L），預擴增產物作為選擇性擴增反應的模板稀釋3，5，10，20倍后作為選擴的模板。選擇性擴增的反應體系見表3，反應條件為94℃150 s；94℃1 min，65℃45 s，72℃1 min，共13個循環；退火溫度每個循環下降0.7℃；94℃1 min，56℃45 s，72℃1 min，共23個循環；72℃6 m in；16℃保存。經6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測選擇性擴增產物，100 V預電泳30 min，再700 V電泳4 h電泳后銀染觀察。

表1 預擴增反應體系各組分的加入量Tab.1 Pre-am p lification system added am ount of each com ponent μL

表2 選擇性擴增引物Tab.2 Selective am p lification p rim er

表3 選擇性擴增反應體系各組分的加入量Tab.3 Selectiveamplificationsystemaddedamountofeachcomponent μL

2 結果與分析

2.1 基因組DNA提取結果

12個樣品的基因組DNA提取瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1。取出1μLDNA樣品稀釋100倍后，用紫外分光光度計測OD260、OD280值，并計算OD260/280比值。12個樣品的OD260/280比值均為1.6～ 1.8，說明蛋白質和小分子物質污染較小，且提取的DNA亮度大完整性好，符合PCR的要求。

圖1 基因組DNA提取結果Fig.1 GenomicDNAextractionresults

2.2 DNA雙酶切及連接結果

DNA的雙酶切及與接頭連接結果見圖2。通過圖2得知100～1000bp呈涂抹帶，說明DNA被完全切開，符合MSAP的技術要求。

圖2 DNA雙酶切及連接結果Fig.2 DNAdoubledigestionandjoinresult

2.3 預擴增結果

連接產物稀釋不同倍數后進行預擴增的結果見圖3。結果表明，連接產物稀釋10倍后預擴增產物條帶亮度大，且條帶為100～1500bp，能夠滿足MSAP的技術要求。連接產物稀釋10倍后，對預擴增反應體系進行優化，結果見圖4。結果表明，最佳反應體系為10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.5μL、Mg2+（25 mmol/L）2.0μL、模板2.0μL、E0擴增引物（10 pmol/μL）1.5μL、H0擴增引物（10 pmol/μL）1.5μL、LA Taq（5 U/μL）0.25μL、ddH2O 12.75μL。

圖3 DNA預擴增結果Fig.3 DNA p re-am p lification resu lts

圖4 預擴增體系優化結果Fig.4 Pre-am p lification system optim ization resu lts

2.4 選擇性擴增結果

預擴增產物稀釋不同倍數進行選擇性擴增結果見圖5。結果表明，預擴增產物稀釋10倍后條帶亮度大，能夠滿足MSAP的技術要求。預擴增產物稀釋10倍后，對選擇性擴增反應體系進行優化結果見圖6，結果表明，最佳反應體系為10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）2.0μL、Mg2+（25 mmol/L）4.0μL、模板3.0μL、EX擴增引物（10 pmol/μL）1.0μL、H/MX擴增引物（10 pmol/μL）1.0μL、LA Taq（5 U/μL）0.30μL、ddH2O 11.2μL。12個樣品的選擴結果見圖7，結果表明條帶明亮且清晰，符合后續試驗的要求。

圖5 選擇性擴增結果Fig.5 Selective am p lification result

圖6 選擇性擴增體系優化結果Fig.6 Optim ization result of selective am p lification

3 結論與討論

3.1 結論

蓖麻是一種重要的油料作物，花序是與其產量直接相關的性狀。本試驗以Lm型雌性系蓖麻aLmAB2在營養生長期（4片真葉期）、營養生長到生殖生長轉變期（5片真葉期）、主莖穗開花期、二級分枝開花期的標雌、單雌、兩性系花序，共12個樣品建立其MSAP反應體系。提取不同類型不同發育時期的花序基因組DNA，混合成基因池；用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ的組合，12 h可將DNA酶切完全；16℃條件下，將酶切產物與EcoRⅠ、HpaⅡ/MspⅠ接頭過夜連接；連接產物用于預擴增。優化后的預擴增反應體系為10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.5μL、Mg2+（25 mmol/L）2.0μL、模板2.0μL、E0擴增引物（10 pmol/μL）1.5μL、H0擴增引物（10 pmol/μL）1.5μL、LA Taq（5 U/μL）0.25 μL、ddH2O 12.75μL。預擴增產物稀釋10倍后用于選擇性擴增。優化后的選擇性擴增體系為10× PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.0μL、Mg2+（25 mmol/L）4.0μL、模板3.0μL、EX擴增引物（10 pmol/μL）1.0μL、H/MX擴增引物（10 pmol/μL）1.0μL、LA Taq（5 U/μL）0.30μL、ddH2O 11.2μL。為確定不同類型不同發育時期的花序差異表達基因研究奠定基礎。

圖7 12個樣品選擇性擴增結果Fig.7 12 sam p les op tim ization resu lt of selective am p lification

3.2 討論

3.2.1 酶切對擴增效果的影響 本試驗的雙酶切組合是Eco RⅠ和HpaⅡ/MspⅠ，對DNA的酶切時間進行優化，最終確定12 h酶切完全，能夠最大限度地使整個基因池里的DNA得到充分的酶切，并且酶切片段為100～1 000 bp呈彌散狀態，能夠滿足后續試驗的要求。在試驗過程中酶切不充分，PCR過程中就會丟失遺傳信息，不利于分析差異表達基因。3.2.2 PCR反應體系對擴增效果的影響 PCR預擴增的結果直接影響選擇性擴增的結果，因此，預擴增在本試驗中至關重要［19］。連接產物作為預擴增的模板，濃度過高會增加非特異性條帶的數目，濃度過低會影響預擴增產物的濃度，當連接產物稀釋10倍時，條帶分布在100～1 000 bp能夠滿足后續試驗的要求。成功建立蓖麻預擴增反應體系。PCR的選擇性擴增影響對差異條帶的獲得。Mg2+濃度的增加會增加Taq酶的活性從而增加特異性條帶，但當Mg2+濃度過高時會抑制Taq酶的活性，從而使特異性條帶的數量降低［20］。反應體系中加入的Mg2+（25 mmol/L）是4.0μL時，酶的活性達到最高。

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Estab lish Castor M arked Fem ale Lm Per Fem ale Am photeric Linein flores Cence M SAP Reaction System

ZHAO Yong1，ZHU Guoli2，3，5，HE Zhibiao2，BAO Chunguang1，4，CHEN Xiaofeng1，
JIANG Tongtong1，LI Jiahui1，HUANG Fenglan1，3，5，ZHOU Tingting1，CHANG Xufeng1，LIU Jiaqi1
（1.College of Life Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao 028000，China；2.Tongliao Academy of Agricultural Science，Tongliao 028000，China；3.Inner Mongolia Region Industrial Engineering Research Center of Universities for Castor，Tongliao 028000，China；4.Tongliao Quality and Safety of Agricultural and Livestock Center，Tongliao 028000，China；5.Inner Mongolia Autonomous Key Laboratory of Castorbreeding，Tongliao 028000，China）

The purpose of this experiment was to establish Lm-type female system castor different developmental stagesmarked female，per female，amphoteric system inforescence establish MSAP reaction system.MSAP reaction system established to determine differences in inflorescence type genes at different developmental stages of research to lay the foundation.The results were as follows：extraction of different types at different developmental stages of inflorescence genom ic DNA m ixed into the gene pool.Eco RⅠand HpaⅡ/MspⅠdigested gene pool 12 h. The digestion products and Eco RⅠ，HpaⅡ/MspⅠadapter overnight connection for pre-amplification.The opti-mized system for the pre-amplification reaction 10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（10 mmol/L）2.5μL，Mg2+（25 mmol/L）2.0μL，template 2.0μL，E0amplification primer（10 pmol/μL）1.5μL，H0amplification primer（10 pmol/μL）1.5μL，LA Taq（5 U/μL）0.25μL，ddH2O 12.75μL.Pre-amplification products were diluted 10-fold for the selective amp lification.Selective amp lification system optim ized for 10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（10 mmol/L）2.0μL，Mg2+（25 mmol/L）4.0μL，template 3.0μL，EXamplification primer（10 pmol/μL）1.0μL，H/Mxamplification primer（10 pmol/μL）1.0μL，LA Taq（5 U/μL）0.30μL，ddH2O 11.2μL.

Castor；Inflorescence；MSAP

S563.03 文獻標識碼：A 文章編號：1000-7091（2016）03-0114-07

10.7668/hbnxb.2016.03.017

2016-01-12

國家自然科學基金項目（30760123；31160290；31460353）；國家農業部公益性行業專項（201003057）；內蒙古自治區高等學校“青年科技英才支持計劃”（NJYT-14-A10）；內蒙古自治區科技創新引導項目；內蒙古自治區“草原英才”計劃項目；市校合作項目（SXZD2012018；SXZD2012017；SXZD2012006）；內蒙古自治區高校蓖麻產業工程技術研究中心開放基金項目（BMYJ2011009）

趙 永（1990-），男，內蒙古赤峰人，在讀碩士，主要從事蓖麻分子育種研究。

黃鳳蘭（1973-），女，山東菏澤人，教授，博士，主要從事蓖麻分子育種研究。