SSR結合SRAP標記分析油菜菌核病抗性資源遺傳多樣性

張曉娟，張 羽，趙 輝

（1.陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中 723000；2.陜西理工學院體育學院，陜西漢中 723001）

SSR結合SRAP標記分析油菜菌核病抗性資源遺傳多樣性

張曉娟1，張 羽1，趙 輝2

（1.陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中 723000；2.陜西理工學院體育學院，陜西漢中 723001）

為了更準確、有效地揭示油菜資源遺傳多樣性，探索SSR和SRAP 2種分子標記在油菜菌核病抗性資源遺傳多樣性分析中的應用，采用40對SSR核心引物及陜西理工學院生物學院分子與遺傳實驗室篩選出的40對多態性高、條帶清晰的SRAP引物，對陜西省漢中市農科所經過連續3年牙簽莖稈接種試驗結合多年的田間抗性表現篩選出的43份菌核病抗性較好的油菜材料進行遺傳多樣性分析，并對2種分子標記揭示的多態性條帶數、多態性信息含量（PIC）進行比較。結果表明：2種標記共檢測出634個條帶，SRAP標記檢測的多態性條帶數（335）較SSR（287）高，而SSR引物的平均多態性信息含量（PIC）值較SRAP引物高，分別是0.76和0.69。在遺傳相似系數0.67處，43份油菜材料被分為Ⅲ類，白菜型油菜（豐油10號白菜型選系）可較好地與甘藍型油菜區分。主成分分析（Principal component analysis，PCA）、群體結構分析與聚類分析結果相似，說明SSR與SRAP標記結合能準確有效的反映油菜材料的親緣關系。供試43份油菜材料遺傳相似系數分布在0.65～0.81，表明遺傳相似性較高，親緣關系較近。因此，應進一步加強抗源篩選及引進，對現有材料進行遺傳改良，拓寬其遺傳背景，從而為抗菌核病油菜品種選育奠定基礎。

SSR；SRAP；油菜；菌核病；遺傳多樣性

油菜是我國及世界重要的油料作物之一。油菜菌核病是由真菌核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）侵染引起的一種嚴重危害油菜產量和品質的廣譜性病害［1］。抗菌核病油菜育種是油菜育種的重要目標。抗源篩選對抗病育種非常重要，為油菜抗菌核病雜交育種提供優異的親本資源［2］。研究表明，甘藍型油菜菌核病抗性較白菜型油菜好［3］。因此，從甘藍型油菜中篩選菌核病抗性資源，分析其遺傳多樣性，明確材料間的親緣關系，掌握材料的遺傳背景，對油菜抗病遺傳育種具有重要意義。

分子標記是根據DNA分子多態性開發的遺傳標記，能真實反映不同個體的遺傳差異，是進行遺傳多樣性分析、基因定位與克隆、遺傳進化、指紋圖譜構建、遺傳育種等研究的有力工具［4］。SSR（Simp le sequence repeat），也稱微衛星DNA，是分布于真核生物基因組中的簡單重復序列，通常以2～6個堿基形成的核心序列為單位多次串聯重復，由于重復次數不同導致不同個體的多態性［5］。SSR標記為共顯性標記，特異性及重復性好，是較理想的分子標記。SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）即相關序列擴增多態性標記，是針對不同個體啟動子、內含子及間隔區的長度多態性開發設計的分子標記，對基因的開放閱讀框（ORF）進行擴增［6］。SRAP標記屬半隨機標記，其特點是多態性高，重復性好［7］，適合于植物的形態差異及起源進化分析。目前，SSR、SRAP標記均已廣泛應用于油菜研究中［8-9］。Annisa等［10］通過SSR標記結合細胞學及形態學研究將164份來自不同國家（地區）的白菜型油菜材料分為三大類。Sun等［11］利用634對SRAP引物構建了甘藍型油菜高密度遺傳圖譜，大小為1 604.8 cM，包括19個連鎖群。文雁成等［12］利用SRAP標記分析了我國不同選育時期的130份甘藍型油菜材料的遺傳多樣性及遺傳基礎。陳倫林等［13］利用SSR和SRAP分子標記研究了國內外19份甘藍型油菜遺傳多樣性的差異，分析了不同品種遺傳距離及其與選育年代的關系。

目前，尚未見SSR與SRAP標記結合研究油菜菌核病抗性資源遺傳多樣性的報道。本研究將這2種分子標記結合，對漢中市農科所經過持續3年牙簽莖稈接種試驗及材料田間抗性監測篩選出的43份菌核病抗性較好的油菜材料進行遺傳多樣性分析，旨在明確抗菌核病油菜育種親本材料間的親緣關系，為抗菌核病油菜雜交育種提供較為合理的親本選配，為改良現有油菜，豐富材料遺傳背景提供依據，同時，為分子標記輔助抗菌核病油菜育種奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

43份油菜菌核病抗性材料由漢中市農業科學研究所提供，材料種植于農科所試驗田。供試材料基本信息見表1。

表1 供試油菜材料編號及材料名稱Tab.1 M aterial num ber and nam e

1.2 試驗方法

1.2.1 CTAB法提取油菜基因組DNA 取供試油菜材料幼葉，液氮研磨至粉末狀，采用CTAB法提取基因組DNA［14］，0.8%的瓊脂糖凝膠檢測。

1.2.2 引物篩選、PCR擴增 利用8份系譜清楚具代表性的油菜材料篩選多態性好、條帶清晰的SRAP引物。40對核心SSR引物參考文獻［15］。SSR引物序列來自網址http：//brassica.bbsrc.ac. uk/。PCR反應總體系15μL。2×Taq Master Mix 7.5μL，10μmol/L的正反引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O補足體系，PCR擴增采用復性變溫法，擴增程序：94.0℃預變性5 m in；94.0℃變性1 min，35.0℃退火1 m in，72.0℃延伸1 m in，10個循環；94.0℃變性30 s，50.0℃退火30 s，72.0℃延伸1 m in，35個循環；72.0℃延伸10 m in，4.0℃保存。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳及染色 采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產物。電泳結束后將凝膠剝下，將一角切去少許以標記方向，置于搖床上染色約8 min，回收染色液，蒸餾水漂洗10 s，加入顯色液，搖床上顯色至有清晰條帶，照相。

2 結果與分析

2.1 SSR和SRAP引物的擴增條帶數及多態性信息含量（PIC）

利用40對SSR核心引物及篩選出的40對多態性好的SRAP引物（SRAP組合及序列見表2）在43份供試油菜材料中共檢測出634個條帶，其中多態性條帶622個，多態性條帶比率98.11%。SRAP引物檢測的條帶數（343）及多態性條帶數（335）較SSR引物高（分別是291和287）。

SSR引物的PIC值平均為0.76，較SRAP（0.69）高。每個SSR位點的PIC值為0.53～0.98，每個SRAP位點的PIC值為0.31～0.99。根據Botstein等［17］提出的當PIC＞0.5時，該基因座為高度多態基因座，0.25＜PIC＜0.5時為中度多態基因座，PIC＜0.25時為低度多態基因座。表明本試驗的SSR及SRAP引物多態性豐富。

表2 SRAP引物組合及序列Tab.2 SRAP prim er pairs and sequence

2.2 材料間遺傳相似系數分析

SSR標記結合SRAP標記分析的供試43份油菜材料間遺傳相似系數為0.65～0.81，平均值為0.70。材料豐油10號白菜型選系與HL1203選系遺傳相似系數最小（0.65），材料雜0982選系與秦優198選系遺傳相似系數最大（0.81）。

2.3 SSR和SRAP標記的聚類分析

SSR和SRAP標記構建的遺傳相似系數和聚類圖如圖1所示，在相似系數0.67處分為三類。第Ⅰ類包括SY13AB和中雙11/榮油801 2個材料。第Ⅱ類包括中雙10號選系、中雙11號選系-1、秦優168選系、秦優2177選系、馳雜油1號選系等39個材料。第Ⅲ類有2個選系材料：雜26選系和豐油10號白菜型選系。在該聚類圖中，來源于同一材料揚油6號的編號為3、4的材料聚在一起；親緣關系較近的材料如秦優7號/1135-4與陜油8號/秦優7號，中雙11號選系-1與漢3B，中油雜2號與希望98，秦優7號/恢702、秦優7號/1135-4、陜油8號/秦優7號及701//秦優7號/1009-1聚在一起。此外，供試材料中唯一的白菜型油菜（豐油10號白菜型選系）可與其他材料（甘藍型油菜）區分開。說明SSR結合SRAP標記能準確反映油菜材料親緣關系及類型。

圖1 SSR結合SRAP分子標記構建的43份油菜材料的聚類圖Fig.1 Cluster dendrogram of 43 rapeseed m aterials constructed by SSR and SRAP m olecular m arker

2.4 SRAP和SSR標記的主成分分析

圖2 SSR結合SRAP標記構建的前2個主要主成分坐標圖Fig.2 Bip lot of the first two m ajor p rincipal com ponents extracted from SSR and SRAP data

主成分分析（PCA）結果與聚類分析結果相似。中雙11/榮油801在聚類分析中歸為第Ⅰ類，在PCA圖中也與其他材料區分開。聚類中在第Ⅱ類且距離較近的材料陜油8號/秦優7號選系與701//秦優7號/1009-1、中雙11號選系-2與天禾油1201選系、SWU10V01選系與H29J24選系在PCA圖中也歸在一起。材料雜26選系與豐油10號白菜型選系均在聚類分析的第Ⅲ類，在PCA圖中也劃在一起。同一材料揚油6號選系-1不同編號的3號和4號樣品在PCA圖中聚在一起。第一主成分和第二主成分分別占總變異的6.44%和6.11%（圖2）。

2.5 SSR和SRAP標記的群體結構分析

當K=3時，Ln P（D）值最大。43份油菜材料被分為3組（圖3），第Ⅰ組包括聚類分析中第Ⅰ類的SY13AB、中雙11/榮油801及聚類中與第Ⅰ類相距較近的寧油16號選系、編號3、4的揚油6號選系-1等10個材料。第Ⅱ組29個材料在聚類圖中也歸為第Ⅱ類。第Ⅲ組包括聚類中第Ⅲ類的雜26選系、豐油10號白菜型選系及與第Ⅲ類相距較近的馳雜油1號選系、312A/HSTC//SZ 4個材料。綜上所述，Structure分析結果同樣與聚類分析結果具有較好的一致性。

圖3 SSR結合SRAP標記構建的43份油菜材料的群體結構分析圖（K=3）Fig.3 Popu lation structure of the 43 accessions by SSR and SRAP m olecu lar m arker（K=3）

3 討論與結論

抗菌核病育種被認為是防治油菜菌核病既經濟、有效又環保的措施。萬華方等［18］以菌核病抗性突出的野生型甘藍C01材料為親本，通過人工合成甘藍型油菜途徑，合成了抗性高于中雙9號的甘藍型油菜。篩選高抗品種作為雜交親本是提高油菜菌核病抗性的有效手段。目前，已篩選到一些抗（耐）病性較好的甘藍型油菜材料［19］。分析抗性資源的遺傳多樣性對抗病遺傳育種中的雜交親本選配具有較好的理論參考價值。

不同分子標記反映的是DNA不同區域的多態性，檢測范圍不同。SSR標記檢測的是均勻分布在基因組的簡單重復序列的多態性，SRAP標記針對的是開放閱讀框（ORF）。本研究將這2種標記結合能更全面的檢測不同個體基因組的多態性，充分反映材料間的遺傳差異，從而較為準確地揭示研究材料間的親緣關系。為了更快速有效地反映材料的遺傳多態性，研究利用40對SSR核心引物及從120對引物組合中篩選出的40對SRAP引物進行擴增。同時，本研究綜合運用了聚類分析、主成分分析及群體結構分析法研究供試油菜材料遺傳多樣性。分析結果表明，PCA與群體結構分析結果同聚類分析結果具有較好的一致性，都是親緣關系較近的材料聚在一起，進一步驗證了聚類分析的準確性，反映了SSR結合SRAP標記能真實客觀的反映材料遺傳背景。

此外，通過對比2種標記構建的聚類圖及SSR與SRAP單獨構建的聚類圖得出，SRAP標記更接近于2種標記共同分析的聚類結果。同時，SRAP標記能較好地將白菜型油菜與甘藍型油菜區分，而SSR標記則不能，反映SRAP標記較SSR標記更適合于區分不同類型的油菜材料，這可能與SRAP標記多態性高有關，研究與譚祖猛等［20］研究結果一致。本研究中SRAP引物的PIC值較SSR低，這是由于SRAP引物只是從120對引物中篩選而得，而SSR引物為核心引物，核心引物較一般引物具有更豐富的多態性，因此，應進一步篩選SRAP引物，建立一套油菜中的SRAP核心引物，應用于油菜種質資源遺傳多樣性分析效果將更好。

2種分子標記分析結果顯示，供試43份油菜材料遺傳相似系數分布在0.65～0.81，說明供試材料的親緣關系較近，遺傳背景較為狹窄，需加強油菜菌核病抗性資源篩選，豐富抗菌核病油菜育種中的親本資源；不斷引入優良的種質資源，拓寬現有油菜遺傳背景。根據本研究聚類分析結果，在進行抗菌核病油菜材料改良中，建議選擇遺傳相似系數較遠的材料如雜雙6號選系、豐油10號白菜型選系與中雙11/榮油801、HL1203選系、滬油16號選系、中雙11號選系-1等材料進行遺傳改良。

致謝：感謝陜西省教育廳項目（14JK1152）資助，感謝漢中市農科所提供試驗材料，感謝西北農林科技大學胡勝武教授對本文提出寶貴修改意見。

［1］ 李 慧，文 李，劉 凱，等.油菜抗菌核病機制研究進展［J］.作物研究，2015，29（1）：84-90.

［2］ 劉正立，劉春林.甘藍型油菜抗菌核病研究進展［J］.中國農學通報，2015，31（15）：114-123.

［3］ 梅家琴.甘藍與甘藍型油菜C亞基因組遺傳關系調查及甘藍抗菌核病QTL定位［D］.重慶：西南大學，2011：110-124.

［4］ 黃龍花，吳清平，楊小兵.基于特定引物PCR的DNA分子標記技術研究進展［J］.生物技術通報，2011，26（2）：61.

［5］ 張征鋒，肖本澤.基于生物信息學與生物技術開發植物分子標記的研究進展［J］.分子植物育種，2009，7（1）：130-136.

［6］ Li G，Quiros C F.Sequence-related amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simp le PCR reaction：its application tomapping and gene tagging in Brassica［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2/3）：455-461.

［7］ Ferriol M，Pic B，Nuez F.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLPmarkers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2003，107（2）：271-282.

［8］ LiWei，Jiang Wei，Zhao Huixian，et al.Genetic diversity of rapeseed accessions from different geographic locations revealed by expressed sequence Tag-Simple sequence repeat and random amplified polymorphic DNA markers［J］.Crop Science，2012，52（1）：201-210.

［9］ 李小白，張明龍，崔海瑞.油菜EST-SSR標記的建立［J］.分子細胞生物學報，2007，40（2）：137-144.

［10］ Annisa，Chen S，Cowling W A.Global genetic diversity in oilseed Brassica rapa［J］.Crop&Pasture Science，2013，64：993-1007.

［11］ Sun Zudong，Wang Z，Tu Jinxing，et al.An ultradense genetic recombination map for Brassica napus，consisting of 13551 SRAP markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2007，114（8）：1305-1317.

［12］ 文雁成，王漢中，沈金雄，等.用SRAP標記分析中國甘藍型油菜品種的遺傳多樣性和遺傳基礎［J］.中國農業科學，2006，39（2）：246-256.

［13］ 陳倫林，鄒小云，李書宇，等.SSR和SRAP標記揭示甘藍型油菜遺傳多樣性的差異分析［J］.分子植物育種，2008，6（3）：511-516.

［14］ Doyle J J，Doyle J L.Isolation of plant DNA from fresh tissue［J］.Focus，1990，12：13-15.

［15］ 李海渤，楊 軍，呂澤文，等.甘藍型油菜SSR核心引物研究［J］.中國油料作物學報，2010，32（3）：329-336.

［16］ Pritchard JK，Stephens M，Donnelly P.Inference of population structure using multilocus genotype data［J］.Genetics，2000，155：945-959.

［17］ Botstein D，White R L，Skolnick M，et al，Construction of a genetic linkage map in man using re striction fragment length polymorphisms［J］.Am J Hum Genet，1980，32：314-331.

［18］ 萬華方.高抗菌核病野生甘藍C01抗性機理及其應用［D］.重慶：西南大學，2013：19-24.

［19］ 姜偉麗.油菜抗菌核病品種的篩選和抗性機理分析［D］.南京：南京農業大學，2008：10-14.

［20］ 譚祖猛，李云昌，胡 瓊，等.SSR和SRAP標記研究油菜雜交種骨干親本的遺傳多樣性［J］.農業生物技術學報，2009，17（5）：882-890.

Genetic Diversity of Sclerotinia sclerotiorum Resistant Brassica napus Based on SSR and SRAP

ZHANG Xiaojuan1，ZHANG Yu1，ZHAO Hui2
（1.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China；2.Department of Physical Education，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，China）

In order to disclose the genetic diversity of Brassica napus accurately，exp lore the application of two molecular markers（SSR and SRAP）in genetic diversity analysis in Sclerotinia sclerotiorum resistant Brassica napus，forty core SSR primers and forty selected SRAP primers with high polymorphism and clear bands from molecular and genetic laboratory in department of Biological of Shaanxi University of Technology were used to analyze 43 Sclerotinia sclerotiorum resistant rapeseed materials identified with stem inoculation method by Hanzhong Institute of Agricultural Sciences.The polymorphism bands and PIC value revealed by the two markers were analyzed.The results showed that，634 polymorphism bands were detected by two markers，the polymorphism bands detected by SRAP（335）was higher than SSR（287），but the average PIC value of SSR primer was higher than SRAP primer，thatwas 0.76 and 0.69 respectively.The 43 rapeseed accessions were divided into three clusters at the coefficient cut off value 0.67.The principal component analysis（PCA）and the population structure analysis resultswere similar to the result of cluster analysis，showed that combination of SSR and SRAP marker could reflect the relationship of rapeseed accurately.Genetic similarity coefficient of the 43 rapeseed samples distributed mainly between 0.65 and 0.81，disp layed that the tested rapeseed materials had a near relationship and a relatively high genetic sim ilarity. Thus，it′s of great importance to introduce and enhance the selection of Sclerotinia sclerotiorum resistant lines to broaden the genetic background of current ones for further Sclerotinia sclerotiorum resistance breeding.

SSR；SRAP；Brassica napus；Sclerotinia sclerotiorum；Genetic diversity

S565.03 文獻標識碼：A 文章編號：1000-7091（2016）03-0169-06

10.7668/hbnxb.2016.03.025

2016-03-20

陜西省教育廳項目（14JK1152）

張曉娟（1980-），女，陜西咸陽人，講師，在讀博士，主要從事油菜分子遺傳學研究。