穴位埋線對癲癇大鼠海馬神經元細胞凋亡及氨基酸的影響

金澤,曹曉婷,王春英,王玉琳,陳靜(.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院,哈爾濱 5000;.黑龍江中醫藥大學,哈爾濱 50040)

穴位埋線對癲癇大鼠海馬神經元細胞凋亡及氨基酸的影響

金澤1,曹曉婷2,王春英1,王玉琳1,陳靜1
(1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院,哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫藥大學,哈爾濱 150040)

目的探討穴位埋線對癲癇大鼠海馬神經元氨基酸及細胞凋亡的影響。方法選取50只Wistar大鼠,每組10 只,隨機分為空白對照組、模型組、穴位埋線組、針刺組、丙戊酸鈉組。除空白對照組外,其他4組均用青霉素鈉腹腔注射造模,穴位埋線組第1、4、7天重復埋線。第7天模型組、穴位埋線組、針刺組及丙戊酸鈉組再一次腹腔注射青霉素鈉點燃模型大鼠,所有動物均在第7天治療后斷頭取腦,剝離海馬。標本切片觀察各組大鼠海馬神經元形態學改變(原位末端標記法)。并檢測海馬內谷氨酸(Glu)、g-氨基丁酸(GABA)的含量(高效液相色譜儀),計算GABA/Glu比值。結果空白對照組大鼠海馬神經元細胞正常,陽性凋亡細胞稀疏,模型組、針刺組、穴位埋線組及丙戊酸鈉組均可見不同程度海馬細胞凋亡現象。與模型組相比,穴位埋線組、針刺組及丙戊酸鈉組海馬細胞凋亡現象明顯降低(P＜0.01),丙戊酸鈉組低于穴位埋線組(P＜0.05),穴位埋線組低于針刺組(P＜0.05)。模型組海馬區興奮性氨基酸Glu的含量較空白對照組明顯增加(P＜0.01),穴位埋線組、針刺組及丙戊酸鈉組與模型組對比海馬內Glu的含量明顯減少(P＜0.01),且穴位埋線組及丙戊酸鈉組Glu水平少于針刺組(P ＜0.05),穴位埋線組及丙戊酸鈉組間無明顯差異(P＞0.05)。模型組海馬區GABA的含量低于空白對照組(P＜0.01)。穴位埋線組、針刺組及丙戊酸鈉組GABA的含量均高于模型組(P＜0.01),穴位埋線組、丙戊酸鈉組及針刺組間GABA含量無明顯差異(P＞0.05)。模型組GABA/Glu比值低于空白對照組(P＜0.01),穴位埋線組、針刺組、丙戊酸鈉組GABA/Glu比值高于空白對照組(P＜0.01),穴位埋線組、丙戊酸鈉組及針刺組間GABA/Glu比值無明顯差異(P＞0.05)。結論重復穴位埋線可明顯阻止癲癇大鼠海馬神經元細胞凋亡的發生發展并可通過調節腦內興奮性與抑制性氨基酸的水平而發揮抗癲癇作用。

穴位療法;埋線;癲癇;海馬;細胞凋亡;氨基酸;大鼠

[Abstract]Ob jectiveTo investigate theeffectof acupointcatgutembedding on hippocampalneuronalamino acidsand apoptosis in epilepsy rats.M ethodFiftyWistar ratswere random ized into blank control,model,acupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproategroups,10 rats each.Amodelwasmade by intraperitoneal injection of penicillin in all thegroupsexcept theblank controlgroup.Catgutembedding was repeated in the acupoint catgutembedding group at day 1,4 and 7.At day 7,penicillin was intraperitoneally injected again to ignitemodel rats in theacupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproate groups.A ll the animalswere decapitated at day 7 to take the brain and separate the hippocampus.The specimen was sliced to observe morphological changes in hippocam pal neurons(in situ end labeling techniques).Hippocam pal glutam ic acid(Glu)and g-aminobutyric acid(GABA)contentswerealsomeasured(high performance liquid chromatography).The ratio of CABA/Gluwas calculated.ResultHippocampal neuronswere normaland apoptosis-positive cellswere sparse in theblank control group of rats. Differentdegreesof hippocampal apoptosiswere seen in themodel,acupoint catgutembedding,acupuncture and sodium valproate groups.Hippocampal apoptosis reduced significantly in theacupoint catgutembedding,acupunctureand sodium valproate groups compared with themodel group(P＜0.01).It decreasedmore in the sodium valproate group compared with the acupoint catgut embedding group(P＞0.05)and did in the acupoint catgut embedding group compared with the acupuncture group(P＞0.05). Hippocampalexcitatory am ino acid Glu content increased significantly in themodelgroup comparedwith theblank controlgroup(P ＜0.01)and decreased significantly in the acupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproategroups comparedwith the model group(P＜0.01).G lu levelswere low er in the acupoint catgut embedding and sodium valp roate groups than in the acupuncture group(P＞0.05)and therewas no significant differencebetween theacupointcatgutembedding and sodium valproate groups(P＞0.05).HippocampalGABA contentwas lower in themodelgroup than in the blank controlgroup(P＜0.01)and higher in the acupoint catgut embedding,acupuncture and sodium valproate groups than in themodel group(P＜0.01).Therewas no significant difference in theGABA contentbetween the acupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproategroups(P＞0.05).The ratio of CABA/Glu was lower in themodel group than in theblank controlgroup(P＜0.01)and higher in the acupoint catgutembedding,acupunctureand sodium valproategroups than in the blank control group(P＜0.01).Therewasno significant difference in the ratio of CABA/Glu between theacupointcatgutembedding,acupunctureand sodium valproate groups(P＞0.05).ConclusionRepeated acupointcatgutembedding can obviously prevent theoccurrence and developmentof hippocampal neuronal apoptosis in epilepsy rats.Itproducesan antiepileptic effectby regulating excitatory and inhibitory am ino acid levels.

[Keywords]Acupoint therapy;Catgutembedding;Epilepsy;Hippocampus;Apoptosis;Amino acid;Rats

癲癇(epilepsy)是一種臨床常見、反復發作的慢性腦部疾病,病因復雜,臨床表現多樣,病程纏綿難愈。有學者發現癲癇患者30%～70%存在認知功能障礙[1-7]。目前,癲癇還沒有特效的治療方法,主要采用抗癲癇西藥來控制癲癇發作。現代臨床實踐提示穴位埋線治療癲癇效果較好[8-14]。筆者通過青霉素鈉腹腔注射法,建立大鼠癲癇模型,通過觀察癲癇大鼠海馬神經元細胞凋亡及海馬內神經遞質谷氨酸(Glu)、g-氨基丁酸(GABA)的影響及GABA/Glu比值來探究穴位埋線對癲癇的可能作用機制。

1　材料與方法

1.1動物與分組

成年健康雄性Wistar大鼠50只,體重200～250 g(由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供,許可證號為黑動字P00102004),常規適應性喂養1星期后開始進行實驗,隨機分為空白對照組、模型組、穴位埋線組、針刺組、丙戊酸鈉組,每組10只。

1.2藥物及試劑

丙戊酸鈉(200 mg/片),注射用青霉素鈉(哈藥集團制藥總廠,160萬U/支),滅菌注射用水(天津藥業焦作有限公司,2mL/支)。氨基酸標準品購自美國Sigma公司,用0.1mol/LHCL配制成0.5mmol/L標準貯備液,標準應用液是以0.1 mol/LHCL將貯備液稀釋3倍。鄰苯二甲醛(OPA)為Sigma公司產品,B-巰基乙醇為國產分析純試劑。所有實驗用超純水系自備3次石英蒸餾水。衍生試劑,10 mgOPA溶于0.5 mL甲醇中,加b-巰基乙醇30mL與0.4 mol/L硼酸緩沖液(pH9.4)至4.5 mL即成。

溶液配制:丙戊酸鈉,取200mg丙戊酸鈉,研細末,加蒸餾水至10 mL,配成20 mg/mL濃度,灌胃。青霉素鈉,取青霉素鈉160萬U,加滅菌注射用水2mL配成570 萬U/mL。

1.3大鼠癲癇模型造模方法

通過參考文獻[15-16]介紹及預實驗的方法,除空白對照組外,其余4組用微量注射器將青霉素鈉通過腹腔注射入大鼠體內,青霉素鈉劑量為570萬U/kg,參考Racine R[17]標準,判斷大鼠是否出現癲癇狀態(Ⅰ級為口角和面部抽動;Ⅱ級為Ⅰ級＋點頭;Ⅲ級為Ⅱ級＋前肢陣攣;Ⅳ級為Ⅲ級＋后腿站立;Ⅴ級為Ⅳ級＋跌倒;以大鼠出現Ⅳ～Ⅴ級發作,且持續20 min為造模成功)。

1.4治療方法

1.4.1空白對照組

腹腔注射與模型組同等劑量的生理鹽水,常規喂養7 d。

1.4.2模型組

青霉素鈉致癲癇大鼠,常規喂養。

1.4.3針刺組

青霉素鈉致癇后,以乙醚吸人麻醉后固定,參照《實驗針灸學》[18],選取大鼠百會、長強穴,用0.35mm ×25mm毫針針刺10mm,行平補平瀉手法,每次30min,每隔10 min行針1次,每日針1次,治療7 d。

1.4.4穴位埋線組

青霉素鈉致癇后,采用0.5 mm羊腸線在百會、長強穴穴位埋線10 mm,分別在1 d、4 d、7 d重復埋線。

1.4.5丙戊酸鈉組

青霉素鈉致癇后行丙戊酸鈉灌胃,每日2次,灌7 d。劑量為成人每天15 mg/kg(體重)按體表面積換算成大鼠。

第7天除空白對照組外其他4組均再行一次青霉素鈉腹腔注射(同造模方法一樣)使模型大鼠癇性放電,然后進行治療之后處死取材。

1.5觀測指標

所有動物均在7 d治療后,立即處死。乙醚麻醉,后用40 g/L多聚甲醛心臟灌注以固定,斷頭取腦,在冰盤上迅速開顱取腦組織,切除腦干及小腦,沿正中矢狀面切開大腦,剝離海馬,稱質量后于﹣80℃低溫保存待測。

1.5.1大鼠海馬神經元形態學改變及細胞凋亡指數比較觀察

標本常規脫水、浸蠟、包埋后冠狀連續石蠟切片經蘇木精-伊紅染色光鏡下觀察各組大鼠海馬神經元形態學改變。

原位末端標記法(Tunel)檢測大鼠海馬神經元DNA片段化的情況。本實驗采用半定量法檢測細胞凋亡指數,反映凋亡細胞DNA片段化情況。細胞核中有紫或深藍褐色顆粒者為陽性染色細胞。每張切片計數3個不同視野(×400)內的陽性細胞數,取平均數作為細胞凋亡指數。神經元細胞凋亡情況,用原位細胞凋亡檢測法染色的切片中,細胞核中有紫或深藍褐色顆粒者為陽性染色細胞(即凋亡細胞)。

1.5.2大鼠海馬氨基酸測定

取解凍后的海馬,用電子天平稱重,加l mL無水乙醇,在冰浴下超聲破碎制成勻漿液,4℃低溫離心(12000 rpm,10 min)。取該上清液10mL加100mL衍生試劑混勻,反應1～2 min后進樣。并采用高效液相色熒光法進行檢測。檢測海馬內谷氨酸(Glu)、g-氨基丁酸(GABA)的含量,并計算GABA/Glu比值。得到的結果換算成mmol/g濕重。儀器:LC-6A型液相色譜儀(日本島津公司),SCL-6A系統控制器,CTO-6A柱溫箱,RF-10AXL熒光檢測器;TGL-16C離心機;ER-18A型電子天平(日本)。

色譜條件:采用Nova-PakC18柱(4.6mm×150mm, 5mm)色譜柱;柱溫35℃;流動相為50 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH6.8)、甲醇和四氫呋喃(A液82:17:1,B液22:77:1),流速為1 mL/min,進樣量為20mL,熒光檢測器激發波長為338 nm,發射波長為425 nm。

1.6統計學方法

數據采用統計分析軟件SPSS17.0進行統計處理。計量資料用均數±標準差表示,比較采用方差分析。

2　結果

模型組2只大鼠及丙戊酸那組1只大鼠在第7日青霉素鈉點燃時抽搐過度死亡。其中,除空白對照組外,模型組發作持續時間為(182±15.6)s,穴位埋線組、丙戊酸鈉組及針刺組發作時間分別為(69±9.6)s, (64.8±11.2)s,(90±8.1)s;模 型 組 潛 伏 期 為(12.3±2.3)min,穴位埋線組、丙戊酸鈉組及針刺組潛伏 期 分 別 為 (25.3±4.2)min,(30.3±2.9)min, (25±2.9)min,3組與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01),說明穴位埋線、丙戊酸鈉及針刺都對癲癇有改善作用。

2.1各組大鼠細胞凋亡指數比較

空白對照組陽性染色細胞稀疏(見圖1),模型組陽性染色細胞多且密集(見圖1),穴位埋線組(見圖1)、丙戊酸鈉組(見圖1)和針刺組(見圖1)中陽性染色細胞少于模型組但多于空白對照組。比值詳見圖2。

圖1　各組陽性染色細胞

由圖2可知,模型組陽性染色細胞明顯多于空白對照組(P＜0.01),穴位埋線組、針刺組及丙戊酸鈉組海馬細胞凋亡現象明顯低于模型組(P＜0.01),丙戊酸鈉組低于穴位埋線組(P＜0.05),穴位埋線組低于針刺組(P＜0.05)。

圖2　各組大鼠海馬細胞凋亡指數(±s)

2.2各組大鼠海馬氨基酸含量的比較

由圖3可知,模型組Glu含量較空白對照組多,且與空白對照組相比,模型組海馬區興奮性氨基酸Glu的含量增加(P＜0.01)。穴位埋線組、針刺組及丙戊酸鈉組與模型組比較大鼠海馬內Glu的含量明顯減少(P ＜0.01),且穴位埋線組及丙戊酸鈉組Glu水平少于針刺組(P＜0.05),穴位埋線組及丙戊酸鈉組間無明顯差異(P＞0.05)。

由圖4可知,模型組GABA含量較空白對照組少,且由圖3可知Glu含量較空白對照組多,說明癲癇造模成功。模型組海馬區GABA的含量低于空白對照組(P ＜0.01)。但穴位埋線組、針刺組及丙戊酸鈉組GABA的含量均高于模型組(P＜0.01),穴位埋線組、丙戊酸鈉組針刺組間GABA含量無明顯差異(P＞0.05)。

2.3各組海馬氨基酸GABA/Glu比值比較

由圖5可知,模型組GABA/Glu比值低于空白對照組(P＜0.01),穴位埋線組、針刺組、丙戊酸鈉組GABA/Glu比值高于空白對照組(P＜0.01),穴位埋線組、丙戊酸鈉組及針刺組間GABA/Glu比值無明顯差異(P＞0.05)。

圖3　各組大鼠海馬氨基酸Glu的比較(±s)

圖4　各組大鼠海馬氨基酸GABA的比較(±s)

圖5　各組海馬氨基酸GABA/Glu比值比較(±s)

3　討論

相關報道表明,癲癇后神經元死亡,表現為神經元細胞凋亡,由此可知神經元細胞凋亡現象可間接反映癲癇的發作程度。本實驗可知,穴位埋線可明顯減低大鼠海馬神經元細胞凋亡現象,說明穴位埋線可抑制大鼠癲癇的發生發展。而Glu為腦內興奮性氨基酸,它存在于神經末梢胞質中,其興奮性神經毒性作用可導致神經細胞變性和死亡[19],GABA為腦內抑制性氨基酸。Glu與GABA在腦內含量平衡關系影響著癲癇發生[20]。當腦內興奮性與抑制性氨基酸之間平衡被打破,興奮性因素增多,而抑制性因素減少,則導致癲癇發作[21]。穴位埋線能明顯降低青霉素致癇大鼠海馬神經元Glu含量,提高GABA含量,糾正癲癇大鼠海馬Glu和GABA失衡的狀態,調節興奮性氨基酸遞質和抑制性氨基酸遞質的平衡,具有明顯的抗癇作用。

本實驗通過大鼠海馬神經元凋亡情況及海馬氨基酸的變化來表明大鼠癲癇的損害程度,可推測穴位埋線、針刺、西藥都可在一定程度上減少大鼠癲癇情況的發生發展,表明穴位埋線、針刺、西藥都可不同程度地減輕癲癇癥狀或減少癲癇發作對中樞神經系統的損害,在降低Glu的含量方面,穴位埋線較丙戊酸鈉及針刺療效顯著,從而提高GABA/Glu比值,降低癲癇的發作。雖然重復穴位埋線與丙戊酸鈉相比無明顯優勢,但穴位埋線為可被自體吸收的羊腸線,避免了各類西藥的毒副反應,同時避免了反復針刺造成的疼痛,就癲癇而言,穴位埋線還克服了癲癇發作時不易針灸的弊端。

中醫通過幾千年對癲癇的認識與研究,積累了豐富的癲癇治療手段與方法[22-24]。臨床及實驗研究表明,長強及百會為治療癲癇要穴[25-30]。長強為督脈絡穴,督脈統領一身陽氣,故埋線于長強可醒神開竅,調節陰陽,配合督脈與足太陽交會之百會穴,可熄風寧神醒腦,使癲癇得以緩解。配合以針灸為基礎的穴位埋線法,使得癲癇有了方便而行之有效的治療方法。穴位埋線的整個操作過程集合了中醫的針刺、刺血、留針、穴位封閉等多種刺激反應[31-33]。這些反應互相配合,共同發揮作用,形成一種持久柔和而復雜的非特異性刺激沖動,一部分通過傳入神經到達相應神經節段的脊髓后角,抑制相鄰的病理傳導,抑制臟腑內作用,另一部分通過脊髓后角上傳至大腦皮質,抑制病理刺激傳入中樞系統,再通過神經-體液調節來調整臟腑,以治愈疾病[34]。

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Effectof Acupoint Catgut Embedding on Hippocampal Neuronal Apoptosisand Amino Acids in Epilepsy Rats

JIN Ze1,CAO Xiao-ting2,WANG Chun-ying1,WANG Yu-lin1,CHEN Jing1.1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital,Harbin 150001,China;2.Heilongjiang University ofTraditionalChinese Medicine,Harbin 150040,China

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.02.0218

1005-0957(2016)02-0218-05

黑龍江省自然科學基金項目;黑龍江省科技廳面上項目(D201286)

金澤(1965-),男,教授,博士后,Email:j inze3399@163.com

曹曉婷(1988-),女,住院醫師,碩士,Emai l:qiaoyi1988hel ls@163.com

2015-05-20