霍山石斛的組織培養研究

2016-07-31 21:31:10敖靜陳文張云霞

花卉 2016年23期

敖靜陳文張云霞

（1.深圳市雙暉農業科技有限公司深圳 518000 2.深圳市華盛實業股份有限公司深圳 518000）

霍山石斛的組織培養研究

敖靜1陳文2張云霞1

（1.深圳市雙暉農業科技有限公司深圳 518000 2.深圳市華盛實業股份有限公司深圳 518000）

以霍山石斛種子為外植體，不同激素為變量，篩選出霍山石斛種子萌發、增殖培養、生根壯苗培養各階段適宜的培養基配方。結果表明，霍山石斛種子萌發適宜的培養基配方為花寶一號1.5g·L-1+花寶二號0.5g·L-1+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.3mg·L-1+ 香蕉 100g·L-1+ 蔗糖 30g·L-1+ 瓊脂 4.75g·L-1+ 碳粉 0.5g·L-1+ 肌醇 100g·L-1+ 牛肉蛋白胨 1g·L-1，種子萌發狀態好，顏色翠綠。繼代增殖適宜的培養基配方為MS+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+碳粉0.5g/L+牛肉蛋白胨1g/L+瓊脂4.8g/L+6-BA1.5mg/L+KT1.5mg/L，霍山石斛增殖倍數達到2.5，增殖苗生長勢較好，6-BA對霍山石斛增殖實驗增殖的影響顯著，NAA、KT對霍山石斛增殖的影響不顯著。適宜的生根壯苗培養培養基配方為MS+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+碳粉0.5g/L+牛肉蛋白胨1g/L+瓊脂4.8g/L+6-BA1.5mg/L+NAA0.5-1mg/L+IBA1-1.5mg/L。霍山石斛試管苗長勢較好，莖粗壯，平均生根數達到9根以上。6-BA對霍山石斛生根壯苗培養株高影響極顯著，IBA對霍山石斛生根壯苗培養株高影響顯著，6-BA對霍山石斛生根培養莖粗效果極顯著。

霍山石斛；種子萌發；增殖培養；生根壯苗

1 前言

霍山石斛（Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng）又名米斛、龍頭鳳尾草，蘭科石斛屬多年生草本植物。性喜陰涼濕潤、通風多霧的環境[1]。是中國蘭科石斛屬藥用植物中最為珍稀名貴的品種，據本草綱目記載，霍山石斛具有“強陰益精、厚腸胃、補內絕不足，輕身延年”等功效。現代醫學研究表明，霍山石斛含有豐富的石斛堿，多糖等多種活性物質，抗衰老、抗腫瘤、增強免疫力效果顯著[2]。享有“軟黃金”、“千金草”、“中華仙草之最”等美譽[3]。由于霍山石斛種子極難萌發，萌發后生長極為緩慢以及所需自然環境苛刻和過度采伐等原因，野生資源已瀕臨滅絕[4]。針對此類自身繁殖率低的植物，植物組織培養技術是解決霍山石斛快速擴繁難題的重要途徑。本研究以霍山石斛種子為外植體，進行了組培技術的研究，篩選出霍山石斛組織培養各階段的最佳組培配方，建立了種苗快速擴繁技術體系，為霍山石斛的規模化種植優質種苗的獲取提供參考。

2 材料與方法

2.1 種子萌發培養基的篩選

設置四種不同的種子萌發培養基配方，具體配方如：①MS；②花寶一號1.5g/L；③花寶二號0.5g/L；④花寶一號1.5g/L+花寶二號 0.5g/L。添加肌醇 100mg/L、6-BA0.5mg/L、NAA0.3mg/L。采摘成熟未開裂無病斑的飽滿霍山石斛蒴果，流水沖洗1h。超凈工作臺上，先用75％酒精消毒30s，無菌水沖洗3次，再用0.1％的Hg－Cl2溶液消毒20min，無菌水沖洗4～5次，無菌濾紙吸干蒴果表面水分。在石斛蒴果兩端橫切一刀，用鑷子沿霍山石斛蒴果縱向生長方向夾住蒴果，輕輕將霍山石斛種子撒入種子萌發培養基中，每個處理接種20瓶。培養40d后拍照統計種子萌發情況，生長勢，顏色。

2.2 繼代增殖培養基的篩選

以MS為基本培養基，選用L16（43）正交表，共16個處理（表1），6-BA、KT 設置 4 個水平，分別為 0mg·L-1、0.5mg·L-1、1mg·L-1、1.5mg·L-1。NAA 設置 4 個水平分別為 0mg·L-1、0.2mg·L-1、0.5mg·L-1、1mg·L-1。外植體選擇高度1cm左右的霍山石斛無菌苗。每個處理接種20瓶，每瓶接種5棵小苗。培養60d后拍照統計增殖倍數，生長勢。

表1 霍山石斛增殖培養正交實驗方案L16（43）

2.3 生根壯苗培養基的篩選

以MS培養基為基本培養基，選取選用L16（43）正交表，共16個處理（表 2），6-BA 設置 4 個水平，分別為 0mg·L-1，0.2mg·L-1，0.5mg·L-1，1mg·L-1，NAA 和 IBA 設置 4 個水平，分別為 0mg·L-1，0.5mg·L-1，1mg·L-1，1.5mg·L-1。外植體選擇高度達到 1.5cm 的霍山石斛無菌苗，每個處理接種20瓶，每瓶接種5棵小苗。培養90d后拍照統計生根數，株高，莖粗。

2.4 培養條件

表2 霍山石斛生根壯苗正交設計實驗方案L16（43）

試驗中所使用的培養基均添加香蕉100g·L-1、蔗糖30g·L-1、碳粉 0.5g·L-1、牛肉蛋白胨 1g·L-1、瓊脂 4.8g·L-1，pH 為 5.8，溫度（25±2）℃，光照強度 2000Lx，光照時間 10h·d-1條件下培養。

3 結果分析

3.1 種子萌發培養基篩選

播種10d后，各個培養基種子開始萌動膨大，剛開始為淡黃色，后期逐漸轉綠。處理1種子萌發狀態良好，原球莖飽滿，生長勢較好，顏色嫩綠，健壯。處理2種子基本萌發，原球莖較飽滿，生長勢一般，顏色黃綠。處理3種子基本萌發，原球莖細小，生長勢一般，顏色黃綠。處理4種子萌發狀態良好，原球莖飽滿，生長勢最好，顏色濃綠。處理1和處理4種子萌發情況普遍高于其他組培養基，培養40d后顏色翠綠，部分還長出一片嫩葉，其中處理4種子萌發生長勢較優，MS培養基培養次之，單獨加花寶一號或二號其種子萌發狀態不好，原球莖不夠飽滿，顏色黃綠。綜合分析可得適宜霍山石斛種子萌發的培養基配方為：花寶一號1.5g/L+花寶二號0.5g/L培養基+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.3mg/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+瓊脂4.75g/L+碳粉0.5g/L+肌醇100mg/L+牛肉蛋白胨1g/L。培養40d后培養基上充斥了石斛種子，部分種子擠壓在一起而吸收不到營養物質及光照而變黃發白死亡，40d后需轉接一次。

3.2 增殖培養基篩選

繼代增殖培養是植物離體快繁的第二個重要階段，通過增殖培養，促進分蘗數的增大，提高擴繁率。通過將苗高1cm左右的無菌苗接種于各增殖培養基中，60d后統計增殖倍數、生長勢。

表3 霍山石斛增殖試驗極值分析表

從增殖實驗極值分析表（表3）中可以看出，3個因素對其增殖倍數和生長勢的主次關系為：6-BA對霍山石斛增殖的影響力最大，其次是NAA，最后是KT。較優組合是A4B1C4。繼續進行方差分析，由表4方差分析可知，6-BA對霍山石斛增殖實驗增殖的影響顯著，NAA、KT對或霍山石斛增殖實驗增殖的影響不顯著。三種激素對株高效果的影響均不顯著。

表4 霍山石斛增殖試驗方差分析表

不同培養基激素配方，其芽增殖情況各不相同，高濃度的6-BA配合較高濃度的KT及較低濃度的NAA，更容易促進霍山石斛芽增殖。在較高濃度的6-BA下，隨著KT濃度的升高和NAA濃度的降低，其增殖倍數逐漸上升，生長勢均保持在較高水平。增殖倍數最高的是處理13，其平均增殖倍數達到3，其次是處理14，其平均增殖倍數為2.9。處理3和14其6-BA濃度均為1.5mg/L，處理13無添加NAA，KT濃度較高為1.5mg/L，平均增殖倍數最高。而處理14添加了0.2mg/LNAA配合1mg/LKT，增殖倍數稍低為2.9，但也處于較高水平。增殖實驗中各個處理生長勢均較好，平均生長勢得分達到3.6以上。其中處理13和14平均生長勢最好為4.2，因此較高濃度的6-BA配合較高濃度的NAA和較低濃度的KT更有利于霍山石斛增殖苗的生長，其霍山石斛增殖苗長勢較好，顏色翠綠，健壯。若不添加6-BA，不管NAA濃度和KT濃度怎么變化，霍山石斛增殖苗生長勢均較差。綜合以上分析，霍山石斛叢生芽增殖處理以處理13最佳，最佳激素配方為MS+6-BA1.5mg/L+KT1.5mg/L。

3.3 生根壯苗培養基篩選

表5 霍山石斛生根壯苗試驗極值分析表

生根壯苗試驗是組培苗生產的最后一個環節，通過此步驟，促進霍山石斛組培苗生根及枝條的粗壯。將高1.5cm左右的無菌苗接種于各生根培養基中，90d后統計株高、根數、莖粗情況。結果表明：較高濃度的生長素能促進霍山石斛生根。當6-BA濃度為0.5mg/L，NAA濃度為0.5mg/L，IBA濃度為1.5mg/L時，霍山石斛平均生根數最高，達到22.1根，當6-BA濃度為1mg/L，NAA濃度為1.5mg/L時，平均生根數較低是13根。從株高和莖粗來看，當6-BA濃度為0.5mg/L時，IBA濃度在0～1mg/L，NAA濃度在1～1.5mg/L時，霍山石斛生根壯苗試驗中株高最高達到3.6cm，莖粗達到3.4～3.5mm。但若6-BA濃度在0.5mg/L時，IBA濃度為1.5mg/L，NAA濃度為0.5mg/L時，其株高和莖粗反而更低為3.3cm和3.3mm。而當6-BA濃度為1mg/L時反而不利于霍山石斛株高和莖粗的增高。因此較高濃度的6-BA均不利于霍山石斛株高和莖粗的增高。通過表3極值分析可以看出，6-BA、NAA、KT對霍山石斛生根壯苗影響的主次關系為：株高6-BA＞IBA＞NAA，根數、莖粗6-BA＞NAA＞IBA。各個指標下的較優組合為A3B2-3C3-4，各個激素適宜的濃度為6-BA為0.5mg/L，NAA 0.5～1mg/L，IBA 1～1.5mg/L。由表6方差分析可知，6-BA對霍山石斛株高影響極顯著，IBA對霍山石斛株高影響顯著，NAA對霍山石斛株高影響不顯著。6-BA、NAA、IBA對霍山石斛生根效果不顯著。6-BA對霍山石斛莖粗效果極顯著，NAA、IBA對莖粗影響不顯著（見表6）。

綜合以上分析，霍山石斛生根壯苗的最佳激素配方為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5～1mg/L+IBA 1～1.5mg/L。培養時間是90d。當霍山石斛株高達到3cm以上，葉片3片以上，莖粗達到2mm以上，根數達到3根以上即可煉苗后移植室外。

4 討論

以種子為外植體進行無菌播種產生種苗或者形成原球莖并增殖，進而分化發育成完整植株是石斛類組培擴繁的重要途徑，霍山石斛種子萌發對培養基要求不高，MS、花寶均適宜作為霍山石斛種子萌發培養基。本研究結果表明，以霍山石斛種子在花寶一號1.5g/L+花寶二號0.5g/L培養基+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.3mg/L上萌發效果最好。錢文林[5]發現霍山石斛在花寶1號1.0mg/L+花寶2號1.0g/L能進行種子萌發。花寶1號+花寶2號同樣適宜霍山石斛種子萌發誘導，配合低濃度的細胞分裂素和生長素更有利于促進霍山石斛種子萌發。這與胡萬群[6]發現適宜的霍山石斛在1/2MS配合低濃度的BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+10％馬鈴薯汁培養基上能促進未成熟種胚萌發相符。霍山石斛增殖培養過程中，不同的培養基配方其增殖效果各不相同。本研究結果表明，MS+6-BA 1.5mg/L+KT 1.5mg/L上培養增殖倍數能達到2.5，高濃度的細胞分裂素能促進霍山石斛增殖，傅玉蘭[7]等研究發現以MS為基本培養基，添加激素KT3mg/L+2，4-D0.2mg/L，增殖效果最好，KT濃度越高，增殖倍數越高。霍山石斛生根壯苗培養過程中，生長素對生根壯苗影響較大，周則剛[8]等研究發現霍山石斛芽生根的最佳培養基為1/2MS+0.5mg/L IBA。而胡萬群[9]發現霍山石斛在1/2MS+NAA 0.5mg/L中生根效果好，能得到大量整齊一致的霍山石斛種苗。唐英武[9]研究發現，霍山石斛生根的最適培養基為MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L。而本研究發現霍山石斛生根壯苗的最佳激素配方為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5～1mg/L+IBA 1～1.5mg/L，培養出的試管苗從根數、株高、莖粗均達到較高水平。說明高濃度的IBA配合低濃度的NAA更有利于霍山石斛生根。這與劉建美[10]的研究一致。因此細胞分裂素和生長素配合更有利于霍山石斛生根壯苗培養。

5 結論

霍山石斛種子萌發最佳培養基為花寶一號1.5g/L+花寶二號0.5g/L培養基+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.3mg/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+瓊脂4.75g/L+碳粉0.5g/L+肌醇100mg/L+牛肉蛋白胨1g/L，40d需轉接一次。繼代增殖中，MS+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+碳粉0.5g/L+牛肉蛋白胨1g/L+瓊脂 4.8g/L+6-BA 1.5mg/L+KT 1.5mg/L為最佳的增殖培養基配方，增殖倍數能達到2.5，培養時間是60d。生根壯苗培養過程中，適宜的生根壯苗培養基配方為MS+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+碳粉0.5g/L+牛肉蛋白胨1g/L+瓊脂4.8g/L+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5-1mg/L+IBA 1～1.5mg/L，培養時間是90d。通過本試驗篩選出了霍山石斛播種-增殖-生根培養各階段適宜的培養基配方，建立了該途徑的種苗快速繁殖體系，對促進霍山石斛種苗工廠化生產和規模化種植優質種苗的獲取有重要作用。

目前，霍山石斛組培技術研究已有一定進展，但也存在一些問題，主要有：①未從工廠化生產角度研究既能降低成本，又能培養優質試管苗的培養技術，且工廠化培養技術規程尚未有人研究。②種子萌發途徑培育出的試管苗性狀參差不齊。③組培生產和大田移栽銜接較少。針對以上問題，今后的研究可從下方面進行研究：①從節約成本角度改良培育技術，加強光照、溫度、濕度、切割手法等的研究，縮短培養周期，提高生產效率，形成工廠化生產的技術規程。②提高自身育種技術，培育優質的種子資源并加強種質資源的保存。③探索以莖段、葉片、腋芽等為外植體進行組培擴繁技術。④加強大田移植技術的研究，建立大田種植技術規程[11]。