化瘀降濁湯對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β1/母系同源物家族信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

尹學(xué)來 宋豎旗 龐然 呂濟(jì)源 盧建新

摘要：目的 觀察化瘀降濁湯對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）過程TGF-β/母系同源物家族Smad通路中關(guān)鍵因子E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、Smad3、蝸形蛋白（Snail）的影響，探討其保護(hù)腎功能的作用機(jī)制。方法 MTT法測(cè)定不同濃度化瘀降濁湯對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)HK-2的細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算半數(shù)抑制率（IC50）。Western blot和RT-PCR檢測(cè)E-cadherin、Smad3、Snail蛋白和基因表達(dá)，間接免疫熒光檢測(cè)E-cadherin蛋白表達(dá)。結(jié)果 化瘀降濁湯在一定濃度范圍內(nèi)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，IC50為472.017 μg/mL。Western blot和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，化瘀降濁湯中、高劑量組E-cadherin、Smad3、Snail蛋白和mRNA表達(dá)與誘導(dǎo)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，化瘀降濁湯能促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)，與Western blot分析結(jié)果一致。結(jié)論 化瘀降濁湯可能通過調(diào)節(jié)HK-2細(xì)胞TGF-β/Smad信號(hào)途徑中的關(guān)鍵蛋白達(dá)到抑制甚至逆轉(zhuǎn)腎小管EMT，從而對(duì)腎小管間質(zhì)纖維化起到保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：HK-2細(xì)胞；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；化瘀降濁湯；E-鈣黏蛋白；Smad3；蝸形蛋白

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.015

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）08-0054-05

尿路梗阻性疾病引起的腎實(shí)質(zhì)損害稱為梗阻性腎病，對(duì)于泌尿外科而言，引起梗阻性腎損害主要原因?yàn)樯夏蚵方Y(jié)石，梗阻性腎病發(fā)展為終末期腎病的關(guān)鍵病理變化為腎間質(zhì)纖維化。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是啟動(dòng)和維持腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵機(jī)制[1]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）/母系同源物家族（Smads）信號(hào)通路是調(diào)節(jié)EMT和腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵信號(hào)通路。前期研究表明，益氣活血類中藥能明顯改善可復(fù)性單側(cè)輸尿管部分梗阻大鼠模型的的梗阻腎側(cè)及總腎的腎小球?yàn)V過率（GFR）水平[2]。本實(shí)驗(yàn)觀察化瘀降濁湯對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT過程中的TGF-β/Smads關(guān)鍵信號(hào)通路蛋白E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、Smad3、蝸形蛋白（Snail）的影響，探討其保護(hù)腎功能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

人近端腎小管上皮細(xì)胞株HK-2細(xì)胞，北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院柴立民教授惠贈(zèng)。

1.2 藥物及制備

化瘀降濁湯（黃芪30 g，丹參30 g，桃仁30 g，莪術(shù)20 g，紅花10 g）飲片均購(gòu)自康美藥業(yè)。將上述劑量的5倍中藥一半置于煎煮容器內(nèi)，以10倍劑量的雙蒸水浸泡30 min，煮沸2 h，過濾藥渣倒出藥液，將另一半中藥用10倍劑量乙醇煎煮，煎沸2 h，過濾藥渣倒出藥液，合并2次濾液。置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制成膏劑、然后取出，置于真空干燥箱干燥48 h，將干燥的固體研磨成粉劑，用培養(yǎng)液分別配制成所需的濃度，然后濾器過濾，分裝至50 mL離心管中保存。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM/F12（Invitrogen），胎牛血清（Hyclone），Anti-E-cadherin抗體、Anti-Smad3抗體、Anti-Snail抗體（abcam），Goat Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody（CST），High Capacity RNA-to-cDNA Kit、E-cadherin探針、GAPDH探針、Smad3探針、Snail探針（Life Tech），免疫染色一抗稀釋、免疫染色二抗稀釋液、免疫染色封閉液、DAPI（碧云天），Trioton-100（索萊寶），F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（碧云天），TaqMan Gene Expression Master Mix（Life Tech），Trizol Reagent（Invitrogen），MTT（Sigma），重組人TGF-β1（pepro tech），胰酶（杭州吉諾）。6、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)corning），PHS-2F酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠），MCO-18AIC細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO），DZF-6020真空干燥箱（上海-恒科技有限公司），RE52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器），SIAFRT SYNERGYHT多功能酶標(biāo)儀、nanodrop超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific），2020冰點(diǎn)滲透壓儀（美國(guó)ADVANCED），Bio-Rad電泳儀（美國(guó)Bio-Rad），Immobilon-P Transfer Membrane（美國(guó)Millipore），ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad），Applied Biosysterns 7500 Real-Time PCR Systems（美國(guó)ABI）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥液pH值和滲透壓測(cè)定

將MTT試驗(yàn)中最大劑量1920 μg/mL藥液用酸度計(jì)及冰點(diǎn)滲透壓儀器測(cè)定3次，取其平均值，結(jié)果顯示pH值為7.385±0.015，滲透壓為289.673±2.057，兩者均在正常范圍內(nèi)。

2.2 MTT法檢測(cè)HK-2細(xì)胞抑制率

參照文獻(xiàn)[3-4]，采用10 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞24 h可發(fā)生EMT。因此，本實(shí)驗(yàn)采用的藥物作用時(shí)間為24 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HK-2細(xì)胞，胰酶消化液消化后用DMEM/F12培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1×104個(gè)/mL，每孔200 μL接種于96孔板，分為8組，均加200 μL含有10 ng/mL TGF-β1的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h，分為8種不同濃度化瘀降濁湯培養(yǎng)基，使藥物終濃度為0、30、60、120、240、480、960、1920 μg/mL，每種濃度設(shè)5個(gè)平行孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，每孔加5 mg/mL的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出上清，每孔加150 μL二甲基亞砜，在搖床上慢速振蕩10 min，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=1-（給藥組OD值-調(diào)零孔OD值）÷（空白組OD值-調(diào)零孔OD值）×100%。計(jì)算化瘀降濁湯I(xiàn)C50的濃度。

2.3 Western blot檢測(cè)HK-2細(xì)胞蛋白表達(dá)

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HK-2細(xì)胞分為5組，正常組加3 mL正常培養(yǎng)液，其余4組加3 mL含10 ng/mL TGF-β1培養(yǎng)液，24 h后吸出培養(yǎng)基，正常組更換正常培養(yǎng)液，誘導(dǎo)組換為含10 ng/mL TGF-β1培養(yǎng)液，中藥低劑量組換為含10 ng/mL TGF-β1+化瘀降濁湯250 μg/mL培養(yǎng)液，中藥中劑量組換為含10 ng/mL TGF-β1+化瘀降濁湯500 μg/mL培養(yǎng)液，中藥高劑量組換為含10 ng/mL TGF-β1+化瘀降濁湯1000 μg/mL培養(yǎng)液。24 h后吸出培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，無酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞后用RIPA提取總蛋白，BCA法蛋白定量，10%SDS-聚丙烯凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶粉封閉膜1 h，加一抗（E-cadherin、Smad3、Snail稀釋倍數(shù)為1∶5000），4 ℃孵育過夜，洗滌緩沖液清洗3次×10 min，加二抗（稀釋倍數(shù)為1∶8000），37 ℃孵育1 h，于Bio-Rad成像儀中加ECL顯影劑，Bio-Rad系統(tǒng)下曝光成像。應(yīng)用Imag J對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。計(jì)算相對(duì)光密度（OD）值[（處理組目標(biāo)蛋白OD值/處理組內(nèi)參蛋白OD值）÷（空白組目標(biāo)蛋白OD值/空白組內(nèi)參蛋白OD值）]。

2.4 免疫熒光檢測(cè)E-鈣黏蛋白表達(dá)

5組細(xì)胞按上述方法在6孔板中培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS沖洗3次×5 min，0.1%TritonX-100孵育10 min，PBS沖洗3次×5 min。免疫染色封閉液室溫封閉1 h，吸出封閉液不洗，加入E-cadherin一抗（濃度為1∶200），4 ℃過夜沖洗3次×10 min，加入FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（濃度為1∶100），室溫避光孵育1 h，PBS沖洗3次×10 min，DAPI室溫染色5 min，吸出，PBS沖洗3次×5 min。每孔各加入100 μL PBS和抗熒光淬滅封片液1滴，于高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)下拍照成像。

2.5 RT-PCR檢測(cè)HK-2細(xì)胞基因表達(dá)

5組細(xì)胞按上述方法培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，用Trizol從細(xì)胞中提取總RNA，用nanodrop測(cè)定RNA濃度，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用nanodrop測(cè)定cDNA濃度。變性：95 ℃、5 min；擴(kuò)增：95 ℃、10 s，60 ℃、20s。50個(gè)循環(huán)；溶解：95 ℃、10 s，60 ℃、10 s；冷卻：40 ℃、30 s。同步進(jìn)行對(duì)照管家基因GAPDH的定量檢測(cè)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，采用方差分析，滿足正態(tài)性和方差齊性時(shí)，兩兩比較用LSD法，方差不齊用Dunnett's法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 化瘀降濁湯對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞增殖的影響

化瘀降濁湯能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞增殖，并隨濃度的增加抑制率也相應(yīng)增加，結(jié)果見圖1。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果得出IC50為472.017 μg/mL，為便于計(jì)算中劑量取500 μg/mL，低劑量為250 μg/mL，高劑量為1000 μg/mL。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分為5組?？瞻捉M不加任何藥物；誘導(dǎo)組：10 ng/mL TGF-β1；中藥低劑量組：10 ng/mL TGF-β1+250 μg/mL化瘀降濁湯；中藥中劑量組：10 ng/mL TGF-β1+500 μg/mL化瘀降濁湯；中藥高劑量組：10 μg/mL TGF-β1+1000 μg/mL化瘀降濁湯。

4.2 Western blot檢測(cè)化瘀降濁湯對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)HK細(xì)胞E-cadherin、Smad3、Snail蛋白表達(dá)的影響

與誘導(dǎo)組比較，中藥中、高劑量組HK細(xì)胞E-cadherin、Smad3、Snail蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖2、表1。

4.3 間接免疫熒光檢測(cè)化瘀降濁湯對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)HK細(xì)胞E-cadherin、Smad3、Snail蛋白表達(dá)的影響

E-cadherin在HK-2細(xì)胞中表達(dá)較多，加入TGF-β1誘導(dǎo)后表達(dá)量減少，一定濃度的化瘀降濁湯作用后能夠增加E-cadherin蛋白的表達(dá)，與Western blot結(jié)果一致，見圖3。

4.4 RT-PCR檢測(cè)化瘀降濁湯對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)HK細(xì)胞E-cadherin、Smad3、Snail mRNA表達(dá)的影響

與誘導(dǎo)組比較，中藥中、高劑量組HK-2細(xì)胞E-cadherin、Smad3、Snail mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

5 討論

對(duì)于泌尿系結(jié)石引起的機(jī)械性梗阻而言，一般只重視解除梗阻取出結(jié)石，而忽略了解除梗阻后對(duì)腎功能的進(jìn)一步保護(hù)，臨床上由此導(dǎo)致腎單位隱性丟失的情況較為常見。腎小管-間質(zhì)的損傷是各種原因所致進(jìn)行性腎臟病進(jìn)展的決定因素，而腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰的共同特征。EMT在腎間質(zhì)纖維化過程中成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生起著重要作用[5]。TGF-β能誘導(dǎo)并維持EMT[6]，而TGF-β/Smad通路是研究EMT的經(jīng)典通路，由于TGF-β能增加E-cadherin相關(guān)抑制轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而引起E-cadherin表達(dá)量減少。E-cadherin減少使細(xì)胞容易失去極性而與周圍細(xì)胞分離，因此其丟失被視為EMT的起始。Snail是含有鋅指結(jié)構(gòu)的一類核轉(zhuǎn)錄因子，能與人類的鈣黏蛋白啟動(dòng)子上的3種E-box結(jié)合，抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄[7]。Smad3磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)能夠活化EMT過程中相關(guān)基因的表達(dá)，目前關(guān)于Smad3的具體機(jī)制還不清楚，但Smad3能夠促進(jìn)纖維化的看法是明確的。Smad3基因敲除后的小鼠能夠保護(hù)腎組織通過TGF-β介導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化[8]。目前有研究認(rèn)為，腎小管上皮細(xì)胞早期發(fā)生的EMT可以逆轉(zhuǎn)[9-10]。因此，研究中藥對(duì)TGF-β/Smad通路的影響有助于了解其保護(hù)腎功能的具體微觀機(jī)制。

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院著名中西醫(yī)結(jié)合泌尿外科奠基人劉猷枋教授自20世紀(jì)60年代起開展中醫(yī)藥對(duì)上尿路結(jié)石及結(jié)石引起梗阻性腎病的研究。臨床上采用化瘀尿石湯治療上尿路結(jié)石。臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，化瘀尿石湯治療上尿路結(jié)石（氣滯血瘀型）具有提高排石率、改善梗阻積水、減少?gòu)?fù)發(fā)率等作用；并可減少硝酸鈾酞所致大鼠腎損害模型的腎小管萎縮灶數(shù)及腎間質(zhì)纖維增生程度[11]。劉猷枋主任根據(jù)古代中醫(yī)典籍認(rèn)識(shí)、梗阻性腎病的臨床表現(xiàn)及西醫(yī)病理特點(diǎn)，認(rèn)為該病病機(jī)總屬氣虛血瘀，在此病機(jī)認(rèn)識(shí)基礎(chǔ)上，宏觀辨證與微觀辨證相結(jié)合，確立了益氣活血、降濁祛濕的治療原則，并在化瘀尿石湯基礎(chǔ)上酌減破氣破血之品，增加了益氣燥濕的力量，組成化瘀降濁湯。方中黃芪、丹參、莪術(shù)、桃仁、紅花均有抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用[12-15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過誘導(dǎo)組與空白組對(duì)比，TGF-β1能誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT，化瘀降濁湯能抑制HK-2發(fā)生EMT后的細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。Western blot、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，化瘀降濁湯能增加TGF-β1誘導(dǎo)后的HK-2細(xì)胞E-cadherin蛋白和基因表達(dá)、減少Smad3、Snail蛋白和基因表達(dá)，三者隨劑量的增加，表達(dá)強(qiáng)度隨之發(fā)生變化，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，間接免疫熒光測(cè)定E-cadherin蛋白表達(dá)與Western blot結(jié)果一致。而E-cadherin、Smad3、Snail是TGF-β/Smad信號(hào)途徑中的關(guān)鍵蛋白，表明化瘀降濁湯可能是通過調(diào)節(jié)HK-2細(xì)胞中的TGF-β/Smad信號(hào)途徑中的關(guān)鍵蛋白達(dá)到抑制甚至逆轉(zhuǎn)腎小管EMT，進(jìn)而對(duì)腎小管間質(zhì)纖維化起到保護(hù)作用，從而實(shí)現(xiàn)保護(hù)腎功能的目的。

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