六味地黃湯對快速衰老小鼠認知功能及堿性成纖維細胞生長因子/Notch通路表達的影響

吳琨鵬 易健 彭千元 湯艷 周勝強 劉柏炎

摘要：目的 觀察六味地黃湯對快速衰老小鼠認知功能及堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）/Notch信號通路表達的影響，探討其改善認識障礙的作用機制。方法 將小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性對照組和六味地黃湯高、中、低劑量組，頸部皮下注射D-半乳糖制作快速衰老小鼠模型，各給藥組給予相應藥物灌胃。Morris水迷宮系統檢測大鼠學習記憶能力，免疫組化檢測小鼠腦組織bFGF、Notch1、Hes1的表達。結果 與正常組比較，模型組小鼠潛伏期延長、跨臺次數減少（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠潛伏期縮短、跨臺次數增多（P<0.01），六味地黃湯高劑量組較六味地黃湯中、低劑量組和陽性對照組效果明顯（P<0.01）；各給藥組小鼠bFGF、Notch1、Hes1陽性細胞數表達較模型組升高（P<0.05，P<0.01），六味地黃湯高劑量組較六味地黃湯中、低劑量組和陽性對照組升高明顯（P<0.01）。結論 六味地黃湯可能通過增加bFGF的表達，激活Notch信號通路，達到改善衰老小鼠認知功能障礙。

關鍵詞：六味地黃湯；認知功能；堿性成纖維細胞生長因子；Notch1；Hes1；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.019

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）08-0074-03

衰老是很多慢性疾病的基礎，其中老年認知功能障礙發病率較高，嚴重影響老年人群的生活質量。中醫學認為，腦為髓海，靈機記性在腦，腎生髓，通于腦，腎與腦的關系密切，因而改善認知障礙的藥物多具有補腎功效[1]。六味地黃湯為滋補腎陰的經典方劑，三補三瀉，以補為主，補而不膩，研究顯示，六味地黃湯具有健腦益智的作用[2-3]，但具體機制尚不明確。本實驗通過建立快速衰老認知功能障礙模型，觀察六味地黃湯對衰老小鼠認知功能及堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）/Notch信號通路表達的影響，探討其改善認知障礙的可能機制。

1 實驗材料

1.1 動物

昆明種成年小白鼠40只，雄性，健康清潔級，體質量（20±2）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號SCXK（湘）2011-0003。室溫下標準飼料喂養，自由飲水飲食。

1.2 藥物及制備

六味地黃湯（熟地黃24 g，山藥12 g，澤瀉9 g，山萸肉12 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g）飲片購自湖南中醫藥大學杏林藥房。傳統方法煎煮，六味地黃湯濃縮至4 g原藥材/mL，4 ℃冰箱保存備用。維生素E注射液，江西博萊大藥廠，批號20140404。

1.3 主要試劑與儀器

D-半乳糖、SP-9000和bFGF、Notch1、Hes1免疫組化試劑盒，武漢博士德生物公司。TP-1000電子天平（湘儀天平儀器廠），水迷宮動物行為學習記憶系統（法國Viewpoint），BX-51光學顯微鏡及數碼攝影數字彩超圖像分析儀系統（日本Olympus）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

適應性喂養2周后，小鼠死亡4只。余36只隨機分為正常組、模型組、陽性對照組和六味地黃湯高、中、低劑量組，每組6只。除正常組外，其余各組小鼠頸部皮下注射D-半乳糖0.5 g/（kg·d），正常組小鼠予生理鹽水等體積皮下注射，連續8周，復制快速衰老小鼠模型。60 kg體質量人體表面積臨床等效劑量為小鼠六味地黃湯中劑量組給藥量，高、中、低劑量組灌胃量分別為2、1、0.5 g/（kg·d），正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，陽性對照組給予維生素E注射液灌胃。灌胃體積均為10 mL/（kg·d），連續8周。治療前后均采用Morris水迷宮系統檢測大鼠學習記憶能力。第8周行水迷宮實驗后所有小鼠斷頸處死，取腦組織，免疫組化檢測小鼠腦組織bFGF、Notch1、Hes1的表達。

2.2 行為學測試

2.2.1 定位航行實驗 每日固定時間段，每個時間段訓練4次，連續5 d。第1次將小鼠遠離目標象限面向池壁放入池中，記錄小鼠找到平臺的時間（逃避潛伏期），后3次將小鼠分別從其余3個不同象限放入水中，歷時120 s。120 s內找不到平臺者潛伏期記錄為120 s，每次訓練間隔20 s。取其平均值作為小鼠當日的學習成績。

2.2.2 空間探索實驗 第6日撤除平臺，將小鼠從任意一區入水，記錄小鼠120 s內跨越原平臺次數。

2.3 免疫組化檢測小鼠腦組織堿性成纖維細胞生長因子、Notch1、Hes1的表達

將保存的腦組織取出，梯度脫水，石蠟封片、切片、烤片，再按試劑盒說明進行免疫組化檢測，最后行封片處理，400倍鏡下隨機選取6個不重復視野，圖像分析系統測算陽性細胞表達數量。

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，符合正態性及方差齊性者采用方差分析，若方差不齊，則用Tamhane's T2檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 六味地黃湯對模型小鼠學習記憶能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠平均逃避潛伏期延長、跨臺次數減少（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠潛伏期縮短、跨臺次數增多（P<0.01），六味地黃湯高劑量組較六味地黃湯中、低劑量組和陽性對照組效果明顯（P<0.01）。結果見表1。

地黃湯高劑量組比較，##P<0.01

4.2 六味地黃湯對模型小鼠腦組織堿性成纖維細胞生長因子、Notch1、Hes1表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠bFGF、Notch1、Hes1陽性細胞數表達升高，但差異無統計學意義（P>0.05）；各給藥組小鼠bFGF、Notch1、Hes1陽性細胞數表達較模型組升高（P<0.05，P<0.01），六味地黃湯高劑量組較六味地黃湯中、低劑量組和陽性對照組效果明顯（P<0.01）。結果見表2。

5 討論

腦衰老所致認知功能障礙屬于中樞神經系統退行性變，成年哺乳動物內仍存在神經干細胞，正確選擇或開發出能促進神經元再生與重建的藥物，通過修復及替代受損神經元，構建新的神經環路改善認知功能，將會給老年認知功能障礙患者帶來新的希望。干細胞與中醫學先天之精的來源、分布、功能高度相似[4]，腎為先天之本，蟄藏先天之精，而六味地黃湯為滋補腎陰的經典方劑，其具有促進干細胞增殖、分化及益腦健智的作用[5]。

Notch信號通路是在進化過程中一種高度保守的信號轉導系統，在哺乳動物中樞神經系統發育參與神經發生過程，決定著中樞神經系統祖細胞是選擇繼續增殖還是向神經元分化。Notch1則通過Notch信號的改變調控神經干細胞分化為神經元與膠質細胞的比例，Hes1則是Notch信號通路的關鍵靶基因，神經元分化作用也依賴于Hes1，且Hes1亦可通過調節下游的Mash1來調控成體神經細胞的生成，后者被認為與學習記憶有密切關系[6-8]。Notch1及Hes1表達升高提示Notch通路激活干細胞進入增殖階段，反之則為干細胞分化為功能細胞[9-11]。

bFGF是一種多肽分子，具有很強的促細胞生長作用很強，廣泛分布于中樞神經系統中，能促進神經干細胞增殖，激活不同區域的神經元前體細胞潛在的再生能力。而于內源性神經干細胞分化中，能激活Notch通路，誘導Hes1的表達，使NSCs處于增殖狀態，為之后的神經元遷移、分化做好準備[12]。

本實驗結果表明，六味地黃湯高劑量組能顯著增加bFGF、Notch1、Hes1的表達，改善快速衰老小鼠認知能力。我們認為增加bFGF的表達，激活Notch信號通路，可能為六味地黃湯改善衰老認知功能障礙的機制。

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