干擾胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白CPEBs對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞侵襲力的影響

劉紅林　霍峻峰　劉志軍　陳小兵(通訊作者)

河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)外科　開(kāi)封　475000

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干擾胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白CPEBs對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞侵襲力的影響

劉紅林霍峻峰劉志軍陳小兵(通訊作者)

河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)外科開(kāi)封475000

【摘要】目的分析干擾胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白(cytoplasmic polyadenylation element-binding protein，CPEBs)對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells，GSCs)侵襲力的影響。方法對(duì)GSCs進(jìn)行原代培養(yǎng)，分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及空白組，實(shí)驗(yàn)組接受CPEBs干擾處理，對(duì)照組接受空載體轉(zhuǎn)染，空白組正常培養(yǎng)，通過(guò)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)比較各組細(xì)胞侵襲力的變化。結(jié)果通過(guò)Western blot檢測(cè)可見(jiàn)，siRNA-3對(duì)CPEBs干擾效果最佳；顯微鏡下可見(jiàn)，受慢病毒感染的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈綠色熒光表達(dá)，表達(dá)率70%以上；Western blot檢測(cè)可見(jiàn)，受慢病毒感染的實(shí)驗(yàn)組CPEBs蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組與空白組(P<0.05)；處理48 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率達(dá)到21.43%，顯著高于空白組的0.51%及對(duì)照組的1.43%(P<0.05)；MTT檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，處理3 d后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著降低，且低于對(duì)照組與空白組(P<0.05)；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿膜數(shù)量顯著低于對(duì)照組與空白組(P<0.05)。結(jié)論干擾CBEPs后膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲能力均得到大幅度抑制，為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供了新的靶點(diǎn)研究方向，有望在改善膠質(zhì)瘤患者預(yù)后方面發(fā)揮重要作用。

【關(guān)鍵詞】胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白；膠質(zhì)瘤干細(xì)胞；侵襲力

胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白(cytoplasmic polyadenylation element-binding protein，CPEBs)可通過(guò)介導(dǎo)mRNA翻譯影響胞質(zhì)的多聚腺苷酸化，在控制干細(xì)胞發(fā)育、分化、衰老、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[1]。過(guò)往關(guān)于CPEBs的研究多集中于其在各類(lèi)腫瘤組織中的表達(dá)情況，但并未對(duì)其靶向治療作深入研究[2]。為研究干擾CPEBs能否對(duì)細(xì)胞侵襲能力有所影響，本文選取膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells，GSCs)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，取得可靠的結(jié)論。現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)材料U87細(xì)胞系，由美國(guó)菌種保藏中心提供，于常溫下在10%胎牛血清DMEM中原代培養(yǎng)，獲取GSCs細(xì)胞球；慢病毒載體選擇pSRL-SIH1-H1-GFP質(zhì)粒[3]，由天津賽爾生物技術(shù)有限公司提供；感受態(tài)細(xì)胞選擇大腸桿菌DH5a菌株[4]，由大連Takara生物工程有限公司提供。其他材料等均為我實(shí)驗(yàn)室原有設(shè)備。

1．2處理方法

1．2．1慢病毒載體制備：參照文獻(xiàn)CPEBs基因序列及RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則制定RNA干擾靶點(diǎn)序列3個(gè)，據(jù)此合成siRNA，并將其分別轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞，利用免疫印跡試驗(yàn)(Western blot法)選取CPEBs受干擾程度最為顯著的siRNA序列，并依照此序列制DNA Oligo，并使其黏性末端與pSRL-SIH1-H1-GFP質(zhì)粒載體酶切位點(diǎn)一致[3]。將上述產(chǎn)物轉(zhuǎn)至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)其培養(yǎng)物質(zhì)粒進(jìn)行克隆抽提、酶切鑒定，測(cè)序比對(duì)陽(yáng)性克隆提示慢病毒載體制備成功[5-6]。見(jiàn)圖1。

圖1　慢病毒載體組成情況(包含pSRL-SIH1-H1-GFP、

1．2．2慢病毒感染：將制備成功的GSCs細(xì)胞球分為3組，分別為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及空白組，實(shí)驗(yàn)組接受慢病毒感染，對(duì)照組僅接受空病毒載體轉(zhuǎn)染，空白組行正常培養(yǎng)。慢病毒感染前1 d將各組細(xì)胞接種至6孔板中，常溫培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度超過(guò)30%時(shí)，將培養(yǎng)液更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)感染復(fù)數(shù)(MOI)為15，并據(jù)此向?qū)嶒?yàn)組各孔內(nèi)加入制備的慢病毒載體，并加入感染增強(qiáng)劑[7-8]，劑量5 μg/mL，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)；與此同時(shí)，向?qū)φ战M各孔內(nèi)加入空病毒載體，其他處理同實(shí)驗(yàn)組。

1．3檢測(cè)指標(biāo)

1．3．1CPEBs表達(dá)分析：分別于處理24 h、48 h、72 h、96 h及120 h后提取各組細(xì)胞總DNA、總蛋白，并采用逆轉(zhuǎn)錄法、Western blot法檢測(cè)其mRNA、蛋白表達(dá)變化[9]，并借助流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)，觀察細(xì)胞增殖情況；借助噻唑藍(lán)比色分析法(MTT法)對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)[10]。

1．3．2侵襲力變化：參照文獻(xiàn)[11]方法對(duì)各組細(xì)胞侵襲力采用Transwell法進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。侵入細(xì)胞的細(xì)胞核在隨機(jī)8個(gè)×200視野下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1．4隨訪(fǎng)對(duì)2組患者進(jìn)行1～2 a的隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)中觀察不良反應(yīng)及復(fù)發(fā)情況。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1siRNA干擾效果引物序列設(shè)計(jì)及其干擾效果比較見(jiàn)表1。通過(guò)Western blot檢測(cè)可見(jiàn)，siRNA-3對(duì)CPEBs干擾效果最佳。見(jiàn)圖2。

表1　siRNA引物序列設(shè)計(jì)及其干擾效果比較±s)

圖2　Western blot檢測(cè)siRNA干擾效果

2．2感染效果顯微鏡下可見(jiàn)，受慢病毒感染的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈綠色熒光表達(dá)，表達(dá)率在70%以上。見(jiàn)圖3。

圖3　空白組A與實(shí)驗(yàn)組B細(xì)胞綠色熒光表達(dá)情況比較(×200)

2．3CPEBs蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè)可見(jiàn)，受慢病毒感染的實(shí)驗(yàn)組CPEBs蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組與空白組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　各組細(xì)胞CPEBs蛋白表達(dá)量比較

注：與實(shí)驗(yàn)組比較，*P<0.05

2．4細(xì)胞凋亡率處理48 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率達(dá)21.43%，顯著高于空白組的0.51%及對(duì)照組的1.43%(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4　各組細(xì)胞凋亡率比較

2．5細(xì)胞活性變化MTT檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，處理3 d后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著降低，且低于對(duì)照組與空白組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3　各組細(xì)胞活性變化比較±s)

注：與實(shí)驗(yàn)組比較，*P<0.05

2．6細(xì)胞侵襲能力Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿膜數(shù)量顯著低于對(duì)照組與空白組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4　各組細(xì)胞侵襲能力比較±s)

注：與實(shí)驗(yàn)組比較，*P<0.05

3討論

膠質(zhì)瘤是人體常見(jiàn)的腫瘤之一，目前臨床對(duì)于膠質(zhì)瘤的治療方法較多，但仍無(wú)一種療法能夠有效改善患者預(yù)后、保證其生存質(zhì)量[12]，因此，關(guān)于膠質(zhì)瘤發(fā)生機(jī)制及其靶向治療方案的研究是目前臨床討論的重點(diǎn)[13]。CPEBs近年來(lái)在多種惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)，且與學(xué)習(xí)、記憶有關(guān)，提示CPEBs除能夠介導(dǎo)干細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞衰老及突觸可塑性等過(guò)程外，還可能參與了神經(jīng)性疾病的逐代遺傳[2，14]。

膠質(zhì)瘤影響患者預(yù)后的主要原因?yàn)槠渚哂休^高的侵襲、浸潤(rùn)性，因此，單純手術(shù)治療往往無(wú)法達(dá)到根治的目的，而抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的遷移被認(rèn)為是改善患者預(yù)后的重點(diǎn)[15]。CPEBs是一組高度保守的RNA結(jié)合蛋白，在誘導(dǎo)多聚腺苷酸化的翻譯過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)的CBEPs對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和新生血管生成具有極強(qiáng)的促進(jìn)作用[1，9]，因此，本文以抑制CBEPs為主要方案進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，并發(fā)現(xiàn)以慢病毒感染siRNA-3序列可取得良好的感染效果。慢病毒具有宿主范圍廣、外源基因表達(dá)規(guī)律的特點(diǎn)，在目前的基因治療研究中逐漸得到更為廣泛的應(yīng)用[3]，我們構(gòu)建了CBEPs RNA干擾慢病毒表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)染后能夠形成十分穩(wěn)定的siRNA，且實(shí)驗(yàn)組綠色熒光細(xì)胞表達(dá)率超過(guò)70%，說(shuō)明載有特異性靶點(diǎn)干擾序列的慢病毒在轉(zhuǎn)染后取得良好的效果。隨著感染時(shí)間的增加，實(shí)驗(yàn)組CBEPs表達(dá)率、細(xì)胞活性及細(xì)胞侵襲能力顯著降低，細(xì)胞凋亡率也得到上調(diào)，提示對(duì)CBEPs的干擾能夠有效抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，有望在臨床膠質(zhì)瘤的治療中取得一定成效。隨著CBEPs表達(dá)的降低，其生物學(xué)功能出現(xiàn)明顯改變，主要包括：(1)mRNA翻譯抑制減弱。高表達(dá)的CBEPs可通過(guò)形成胞質(zhì)型聚腺苷酸化核糖核蛋白復(fù)合物、結(jié)合Maskin蛋白兩種途徑保持mRNA的poly A尾巴處于較短狀態(tài)、40S核糖體亞基識(shí)別起始密碼子困難，從而影響mRNA翻譯途徑的開(kāi)始，無(wú)法保證mRNA的翻譯輸出[1]。(2)mRNA翻譯激活減弱。CBEPs在延長(zhǎng)poly A尾巴的同時(shí)增加了mRNA的長(zhǎng)度，從而促進(jìn)休眠mRNA的激活、翻譯，引發(fā)細(xì)胞級(jí)聯(lián)信號(hào)的出現(xiàn)，誘發(fā)非正常mRNA翻譯的發(fā)生。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CBEPs在細(xì)胞衰老、突觸可塑性中發(fā)揮的作用使得細(xì)胞多個(gè)生命過(guò)程發(fā)生變化[16-17]，這也是導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變、癌變惡化的重要原因之一，因此，可以認(rèn)為，CBEPs在膠質(zhì)瘤發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等多個(gè)過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，隨著關(guān)于CBEPs研究的進(jìn)一步深入及其機(jī)制的進(jìn)一步闡述，相信對(duì)于CBEPs的控制將會(huì)在今后腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，干擾CBEPs后膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲能力均得到大幅度抑制，為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供了新的靶點(diǎn)研究方向，有望在改善膠質(zhì)瘤患者預(yù)后方面發(fā)揮重要作用。

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(收稿 2016-01-15)

基金項(xiàng)目：河南省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：162102310162)

【中圖分類(lèi)號(hào)】Q813

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-5110(2016)15-0021-03