microRNA141在膠質瘤中的表達及臨床意義

宋　銳　劉宗文(通訊作者)　劉怡伶　袁金金　張　恒　肖陳虎

鄭州大學第二附屬醫院　鄭州　450014

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microRNA141在膠質瘤中的表達及臨床意義

宋銳劉宗文(通訊作者)劉怡伶袁金金張恒肖陳虎

鄭州大學第二附屬醫院鄭州450014

【摘要】目的探討microRNA-141(miR-141)在神經膠質瘤組織和細胞中的表達情況及其與膠質瘤臨床參數的關系。方法Real-time PCR方法檢測60例膠質瘤，15例正常腦組織中miR-141的表達，檢測膠質瘤細胞系U87、U251及人腦正常星型膠質細胞HEB中miR-141的表達，利用統計學工具分析膠質瘤組織中的表達情況與臨床病理參數的相關性。結果與正常星型膠質細胞對比，膠質瘤組織中的miR-141表達升高明顯(P<0.05)，膠質瘤細胞系U87、U251中miR-141表達水平與正常星型膠質細胞HEB中表達水平對比，差異有統計學意義(P<0.05)。膠質瘤組織中mir-141的表達高低與患者腫瘤的大小、WHO分級及Ki67指數密切相關。結論miR-141在膠質瘤癌組織及細胞系中高表達，與腫瘤大小、分化程度及是否轉移相關，提示miR-141能夠作為膠質瘤今后醫療診斷的新指標及治療的新靶點。

【關鍵詞】miR-141；膠質瘤；轉移

膠質瘤是原發于中樞神經系統內最為常見的惡性腫瘤，具有高侵襲性、高復發率和高致死率的特點。膠質瘤約占所有原發顱內腫瘤的28%和顱內惡性腫瘤的80%，在美國每年平均有超過50 000例新發膠質母細胞瘤患者[1]。在中國，在低于19歲的人群中，膠質瘤發生率約占所有類型的55.56% ，高于顱內其他類型腫瘤。對于20～59歲的人群中，31.10%顱內腫瘤為膠質瘤[2]。如今外科手術后行替莫唑胺聯合精準放療已成為目前高級別膠質瘤的一線治療方案，然而膠質母細胞瘤患者的中位生存期仍低于15個月[3]。

miRNA是一類長度18～25個核苷酸的非編碼RNA，在轉錄以后水平調控相應靶基因的表達。miRNA通過與靶mRNA的3'-UTR 區結合，導致靶mRNA 降解或翻譯抑制，下調靶蛋白的表達，從而達到調控靶基因表達的目的[4]。它們可通過抑制腫瘤特定靶點基因的表達來作為癌基因或抑癌基因。大量研究表明miRNA可作為一種新型的標志物來評估腫瘤的發生、發展和對治療的反應[5]。研究發現mir-141在鼻咽癌組織中高表達并與其臨床分期相關[6]，但尚無其在膠質瘤中的研究，因此該研究探討了膠質瘤組織、膠質瘤細胞系中miR-141的表達情況及miR-141與臨床病理參數的相關性。

1材料與方法

1．1實驗材料

1．1．1標本：收集鄭州大學第一附屬醫院神經外科手術切除的新鮮膠質瘤標本60例及正常腦組織15例(腦外傷行部分腦組織切除術的病人)，60例膠質瘤組織均經過臨床病理學證實。標本采集后，迅速放入冰盒中凍存，然后于-80 ℃冰箱中儲存以備提取組織總RNA。

1．1．2細胞：膠質瘤細胞系U87、U251及人腦正常星型膠質細胞HEB均購于上海細胞庫。

1．1．3主要試劑：DMEM/HIGH GLUCOSE培養液購自美國 HyClone公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自美國Gibco公司；RNAiso plus、cDNA逆轉錄試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTM II購自日本TAKARA公司；RT-PCR引物由上海生工合成。

1．2細胞培養U87、U251及HEB均為貼壁細胞，培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM/HIGH GLUCOSE完全培養基中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1．3Real-time PCR利用TRIzol法提取Het-1a及膠質瘤細胞和膠質瘤組織中總RNA，檢測RNA的純度及濃度。結果顯示OD260/280比值均在1.80～2.0，符合要求。按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，按SYBR Green試劑說明書于實時熒光定量PCR儀進行擴增。

1．4統計學方法應用SPSS 21.0統計學軟件分析。均值檢驗采用student’s t test，相關行檢驗采用卡方檢驗，采用GraphPad Prism繪制統計圖，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2．1mir-141在膠質瘤組織及膠質瘤細胞系中均為高表達膠質瘤組織、正常腦組織中mir-141的表達量分別為2.003±0.279 9 vs 0.693 2±0.284 4，差異有統計學意義(t=2.276，P=0.0258<0.05)，見圖1。檢測人腦正常星型膠質細胞HEB及不同膠質瘤細胞系中的表達，發現U87和U251中mir-141的表達量分別為HEB的2.21倍和1.71倍，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1　miR141在膠質瘤組織及正常腦組織中的表達　　圖2　miR141在HEB細胞及不同膠質瘤細胞系中的表達

2．2miR-141表達與腫瘤患者臨床病理參數相關性分析60例膠質瘤患者腫瘤組織中miR-141表達水平與腫瘤病理參數分析結果顯示，其表達與腫瘤大小、WHO分級及Ki67指數密切相關，差異有統計學意義(P <0.05)，而與性別、年齡無相關性(P>0.05)。見表1。

表1　膠質瘤患者miR-141表達量與臨床病理

3討論

近年來腫瘤與miRNAs相關性的研究受到越來越多的重視，諸多研究發現，miRNAs在多種腫瘤的致癌和抑癌過程中發揮重要作用。大量證據表明miRNAs調控著許多細胞過程，包括細胞分化、增殖、凋亡、壓力耐受、代謝以及細胞干性的維持[7]。1個miRNA可能有多個靶點，1個基因也可能受多種miRNAs的調控。因此，miRNAs和它的相關靶點構成了1個能夠調控細胞生長過程的復雜網絡。如miRNAs的下調癌基因的表達，這些基因稱為抑癌miRNAs；相反，如果miRNAs下調癌抑制性基因的表達，這些就稱為促癌miRNAs。Silber等[7]報道了miR-124 和miR-137在高級別膠質瘤中低表達，并且在膠質瘤細胞轉染miR-124 和miR-137后，更多的腫瘤細胞被阻滯在了G0/G1期，表明miRNA具有抑制腫瘤的潛能。我們的研究證明，與正常腦組織組織相比，mir-141在膠質瘤組織中高表達，且食管癌細胞系與正常食管上皮細胞系相比，也顯示出了相同的趨勢。在膠質瘤中mir-141與患者臨床病理參數的相關性分析中發現，其表達與腫瘤大小、WHO分級及Ki67指數密切相關，而與性別、年齡無相關性。這就證明了mir-141可能在膠質瘤的發生、發展及臨床預后方面發揮重要的作用，能夠為膠質瘤的診斷提供新型的標志物。

Mir-141屬于mir-200家族，該家族在腫瘤的發生與發展中發揮重要的作用。近期大量的研究表明mir-141在不同類型的腫瘤中的表現存在差異，Zhou等[8]研究發現，mir-141在胃癌細胞系及胃癌組織中低表達，因其能夠與lncRNA-H19特異性結合，來抑制胃癌細胞系的增殖和侵襲。Van等[9]證明了與順鉑化療敏感的細胞系相比，順鉑耐藥的細胞系中存在表達升高的mir-141，其能夠抑制胞漿蛋白Keap1(Kelch-like ECH-associated protein-1)的表達，從而誘導順鉑的耐藥。Liu等[6]發現，mir-141在鼻咽癌組織中顯著高表達，并與BRD7的表達呈負相關，表明其鼻咽癌病人的生存相關，外源性的mir-141能夠增強腫瘤細胞的增殖能力，抑制凋亡率。另有研究發現，mir-141在神經母細胞瘤細胞系中低表達，并與FUS表達負相關，在給予細胞系慢病毒感染，使mir-141表達增高后，腫瘤細胞的增殖、細胞周期及遷移受到抑制，并增加了其對順鉑化療的耐藥性，從而證明了mir-141在神經母細胞瘤中發揮了關鍵作用[10]。

綜上所述，mir-141在膠質瘤組織及膠質瘤細胞系中高表達，且與膠質瘤患者的臨床病理參數高度相關，mir-141可能作為膠質瘤新型的診斷指標和潛在的治療靶點。本課題組下一步的工作是研究mir-141在膠質瘤中的作用機制，為其在膠質瘤治療中的應用提供參考。

4參考文獻

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[5]Reddy KB. MicroRNA (miRNA) in cancer[J]．Cancer Cell Int，2015，15：38．

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[7]Silber J，Lim DA，Petritsch C，et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells[J]．BMC Med，2008，6：14．[8]Zhou X，Ye F，Yin C，et al. The Interaction Between MiR-141 and lncRNA-H19 in Regulating Cell Proliferation and Migration in Gastric Cancer[J]．Cell Physiol Biochem，2015，36(4)：1 440-1 452．

[9]van Jaarsveld MT，Helleman J，Boersma AW，et al. miR-141 regulates KEAP1 and modulates cisplatin sensitivity in ovarian cancer cells[J]．Oncogene，2013，32(36)：4 284-4 293．

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(收稿 2015-06-12)

【中圖分類號】R739.41

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)15-0025-02