補骨脂素對去勢雌鼠E2、ERβ、TNF-α、IL-17的影響

楊琳 曾英 李勁平 劉珊 王文杰 楊巖冰 莫新民

1. 湖南中醫藥大學， 長沙 410007 2. 中南大學藥學院， 長沙 410013

補骨脂素為補骨脂的主要化學成分，具有促進成骨細胞增殖、分化，可用于骨質疏松癥治療[1-3]。近年有研究表明補骨脂素可與雌激素受體(ER)結合，啟動雌激素受體元件，具有擬雌激素活性[4-6]。壯骨止痛膠囊是本課題組研發的治療原發性骨質疏松的已上市六類中藥新藥，補骨脂是壯骨止痛膠囊中的君藥，而補骨脂素是壯骨止痛膠囊的主要定量控制指標之一。課題組已有研究表明補骨脂素對于雙側去卵巢骨質疏松大鼠模型具有良好抗骨質疏松作用[7]。近年來的研究表明免疫系統在骨質疏松發生發展中發揮了重要作用，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-17(IL-17)在骨質疏松發生發展過程中扮演了重要角色，本研究通過觀察補骨脂素對去勢骨質疏松雌鼠血清雌激素(E2)、ERβ、TNF-α、IL-17水平及骨組織ERβ、TNF-α、IL-17基因表達的影響，探討補骨脂素抗絕經后骨質疏松作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性SD大鼠72只，3月齡，體重210～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質量合格證號NO.43004700005517，湖南中醫藥大學動物實驗中心許可證號：SCXK(湘)2013-0004。

1.2 藥品

壯骨止痛膠囊(四川美大康藥業股份有限公司，批準文號：Z20050118)、補骨脂素(中國藥品生物制品檢定所，純度>98%)，戊酸雌二醇(拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，批準文號：J20130009)，青霉素鈉(哈藥集團制藥總廠，批號：A1301022417)。

1.3 試劑

大鼠腫瘤壞死因子-α檢測試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司，批號：201410)，大鼠白介素-17檢測試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司，批號：201406)，大鼠ERβ免疫組化試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)，雌二醇E2檢測試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司，批號：201406)，TRIZOL試劑(美國Invitrogen公司，批號：28218)，Go Taq Green MasterMix(美國Promega公司，批號：0000110146)，DNA Marker I(天能生物科技有限公司，批號：20140714)，瓊脂糖(天能生物科技有限公司，批號：111860)，TBE液(天能生物科技有限公司，批號：20140714)，水合氯醛(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20120110)，無水乙醇(上海振興化工一廠，批號：201408301)，氯仿(國藥集團化學試劑有限公司，批號：T20101202)，異丙醇(國藥集團試劑有限公司，批號：20120627)，液氮(長沙日臻氣體有限公司)。

1.4 儀器

凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad)，PCR 擴增儀(北京六一儀器廠，型號：WD-9402A)，核酸蛋白分析儀(Eppendorf Biophotometer plus，型號：GPS-9160MBE)，立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠，型號：LDZX-30KBS)，全自動雪花制冰機(常熟市雪科電器有限公司，型號：IMS-30)，電泳儀槽(北京六一儀器廠，型號：DYY-8c)，電泳槽(北京六一儀器廠，型號：DYCP-31DN)，電子天平(奧豪斯儀器有限公司，型號：CP214)，-80度冰箱(Thermo scientific)，-20度冰箱(Haier 低溫冷柜)，-4度冰箱(Haier 冷藏箱)，微波爐(Midea 417-ykk)，移液槍(規格0.5～10 ul；20～200ul；100～1 000 ul)，液氮生物容器(YDS-10 型 編號：20060282)。

1.5 分組及造模方法

72只雌性SD雌鼠，按體重隨機分為假手術組、模型組、戊酸雌二醇對照組、壯骨止痛膠囊對照組、補骨脂素高劑量組、補骨脂素低劑量組共6組，每組12只。每只大鼠分別用2%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 ml/100 g)后，在無菌條件下從距離第一腰椎兩側外1 cm處縱向切開，除假手術組僅切除少許脂肪組織外，其余各組大鼠完整摘除雙側卵巢，徹底止血后分兩層縫合切口。術后各組大鼠切口嚴格用絡合碘消毒，連續3 d肌注獸用青霉素 (4萬u/只/天)抗炎，5 d后拆線。

1.6 給藥方法

各組均從術后一周開始給藥，每天灌胃1次，連續13周。除假手術組和模型組每天灌胃相應體積蒸餾水外，其余各組開始灌胃相應藥物(1 ml/100 g)。劑量按人鼠體表面積折算，戊酸雌二醇對照組按0.21 mg/kg給藥，壯骨止痛膠囊對照組按相當于生藥6.6 g/kg給藥，補骨脂素高、低劑量組分別按8 mg/kg和4 mg/kg給藥。

1.7 指標檢測

實驗過程中，所有大鼠自由飲水攝食，每10天稱體重1次。給藥l3周后，每組選取10只大鼠分別用2%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 ml/100 g)后，切開腹腔，分離腹主動脈插管取血2 ml，待凝固后500 g/min離心分離血清，ELISA法檢測血清中E2、TNF-α、IL-17的含量。提取左股骨組織mRNA樣本進行RT-PCR反應檢測TNF-α、ERβ、IL-17的基因表達，取右股骨脫鈣切片免疫組化檢測ERβ。

1.7.1RT-PCR：(1)總RNA提取：取-80℃保存的左股骨，在研缽中加入液氮研碎，加入1 ml Trizol，按Trizol說明書抽提總RNA，采用紫外分光光度計測定其濃度及純度，A260/A280均在1.8～2.0之間。(2)cDNA合成：采用20 μL逆轉錄反應體系，內含2 μg待測RNA，操作嚴格按照逆轉錄合成說明書執行。(3)引物序列及擴增條件：按照PCR反應條件，取2 μL cDNA模板配成25 μL反應體系進行目的基因擴增。ERβ有意義鏈5′- TCACCGTCGAGCCTTAGTTC -3′，反意義鏈5′- TCTGCATAGAGGAGCGATGA -3′；TNF-α有意義鏈5′-ACGTCGTAGCAAACCACCAA-3′，反意義鏈5′-CTGGGAGTAGATAAGGTACA-3′；IL-17有意義鏈5′ATCCATGTGCCTGATGCTGT-3′，反意義鏈5′-GTTATTGGCCTCGGCGTTTG-3′；內對照β-actin有意義鏈5′- CCTAGCACCATGAAGATCAA -3′，反意義鏈5′- TTTCTGCGCAAGTTAGGTTTT -3′。ERβPCR擴增循環參數：95℃預變性5 min，95℃變性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸30 s，35個循環，最后72℃延伸10 min。TNF-αPCR擴增反應循環參數：95℃預變性5 min，95℃變性30 s、53℃退火30s、72℃延伸30 s，35個循環，最后72℃延伸10 min，擴增片段141 bp。IL-17PCR擴增循環參數：95℃預變性5 min，95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，35個循環，最后72℃延伸10 min，擴增片段106 bp。β-acin擴增循環參數：95℃預變性5 min，95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，35個循環，最后72℃延伸10 min，擴增片段227 bp。(4)半定量分析：各取PCR產物3 ul，用2%的瓊脂糖電泳及溴化已錠染色，經凝膠成像系統(Bio-Rad) 進行拍照，用Image Lab 5.0軟件進行定量分析。計算ERβ、TNF-α、IL-17產物電泳條帶灰度與β-actin產物電泳條帶灰度比值。

1.7.2免疫組化檢測ERβ：取大鼠的完整右股骨，去除附著的肌肉和筋膜后浸泡在10%福爾馬林PBS中脫鈣后按常規切片、脫蠟至水洗后經抗原修復。加3%H202PBS溶液室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，滴加正常山羊血清(1∶10)室溫孵育10 min。滴加兔抗大鼠ERβ抗體，陰性對照切片采用正常羊血清代替一抗，4℃孵育過夜。然后PBS浸洗3次，再滴加生物素標記羊抗兔IgG，室溫反應30 min，PBS浸洗3次，然后滴加HRP鏈霉菌抗生物素蛋白，室溫反應20 min；PBS浸洗3次；然后用0.06%DAB顯色8 min；蘇木精復染，酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。Olympus BX51型顯微鏡下觀察、拍照，在Image-Pro Plus4.5進行圖像分析。

1.8 統計方法

2 結果

2.1 補骨脂素對大鼠血清E2測定結果

與假手組相比，模型組大鼠血清E2水平非常顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，壯骨止痛膠囊顯著升高血清E2水平(P<0.05)，補骨脂素高劑量組血清E2水平顯著升高(P<0.05)，補骨脂素低劑量組血清E2水平升高趨勢明顯，但沒有統計學差異。見表1。

表1 不同組別補骨脂素對去卵巢雌鼠血清E2水平的影響(n=6)Table 1 Effect of psoralen on the serum level of E2 in ovariectomized rats of different groups (n=6).

注：與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05

2.2 補骨脂素對大鼠股骨ERβ表達的影響

與假手組相比，模型組股骨ERβ的mRNA轉錄和表達均顯著降低(P<0.01或P<0.05)。與模型組相比，戊酸雌二醇組ERβ的表達顯著升高(P<0.01或P<0.05)；壯骨止痛膠囊組股骨ERβ基因表達顯著升高(P<0.05)；補骨脂素高劑量組股骨ERβ基因表達顯著升高(P<0.05)，補骨脂素低劑量組對股骨ERβ基因表達沒有統計學差異，見表2。各組ERβmRNA表達電泳圖見圖1，股骨ERβ免疫組化染色見圖2。

2.3 補骨脂素對大鼠血清TNF-α水平及基因表達的影響

與假手組相比，模型組血清TNF-α水平和股骨TNF-α基因表達均非常顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，戊酸雌二醇組血清TNF-α水平和股骨

表2 不同組別補骨脂素對去卵巢雌鼠股骨ERβ表達的影響(n=6)Table 2 Effect of psoralen on ERβ in the femur in ovariectomized rats of different groups (n=6).

注：與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05

圖1 各組ERβmRNA表達電泳圖譜 1：補骨脂素低劑量；2：補骨脂素高劑量；3：戊酸雌二醇；4：假手術組；5：模型組；6：壯骨止痛方；M=DNA MarkerFig.1 The ERβ mRNA expression in each group. 1: Psoralen low dose; 2: Psoralen high dose; 3: Sham operation group; 4:Estradiol group; 5:Model group; 6:ZGZT capsule group; M: DNA Marker.

TNF-α基因表達均非常顯著降低(P<0.01)；壯骨止痛膠囊組股骨TNF-α基因表達非常顯著降低(P<0.01)，血清TNF-α水平顯著降低(P<0.05)；補骨脂素高劑量組血清TNF-α水平和股骨TNF-α基因表達均顯著降低(P<0.05)，補骨脂素低劑量組血清TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，而股骨TNF-α基因表達沒有統計學差異，見表3。各組TNF-αRNA表達電泳趨勢圖譜見圖3。

表3 不同組別補骨脂素對去卵巢雌鼠血清TNF-α水平及股骨TNF-α基因表達的影響(n=6)Table 3 Effect of psoralen on serum TNF-α and the gene expression of TNF-α in ovariectomized rats of different groups (n=6).

注：與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05

2.4 補骨脂素對大鼠血清IL-17水平及其基因表達的影響

與假手組相比，模型組血清IL-17水平和股骨IL-17基因表達均非常顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，戊酸雌二醇組血清IL-17水平和股骨IL-17基因表達均非常顯著降低(P<0.01)；壯骨止痛膠囊組股骨IL-17基因表達非常顯著降低(P<0.01)，血清IL-17水平顯著降低(P<0.05)；補骨脂素高劑量組血清IL-17水平非常顯著降低(P<0.01)，而股骨IL-17基因表達顯著降低(P<0.05)，補骨脂素低劑量組血清IL-17水平和股骨IL-17基因表達均顯著降低(P<0.05)，見表4。各組IL-17 mRNA表達電泳圖譜見圖4。

表4 不同組別補骨脂素對去勢雌鼠血清IL-17水平及股骨IL-17基因表達的影響(n=6)Table 4 Effect of psoralen on serum IL-17 and the gene expression of IL-17 in ovariectomized rats of different groups (n=6).

注：與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05

圖3 各組TNF-αRNA表達電泳趨勢圖譜 1：補骨脂素低劑量組；2：補骨脂素高劑量組；3：假手術組；4：陽性對照組；5：模型組；6：壯骨止痛方組；M：DNA Marker Fig.3 The TNF-α mRNA expression in each group. 1: Psoralen low dose; 2: Psoralen high dose; 3: Sham operation group; 4:Estradiol group; 5:Model group; 6:ZGZT capsule group; M: DNA Marker.

圖4 各組IL-17 mRNA表達電泳圖譜 1：補骨脂素低劑量組；2：補骨脂素高劑量組；3：壯骨止痛方組；4：假手術組；5：陽性對照組；6：模型組；M：DNA Marker Fig.4 The IL-17 mRNA expression in each group. 1: Psoralen low dose; 2: Psoralen high dose; 3: Sham operation group; 4:Estradiol group; 5:Model group; 6:ZGZT capsule group; M: DNA Marker.

3 討論

補骨脂素是補骨脂的主要活性成分，可與雌激素受體(ER)結合，啟動雌激素受體元件調控一系列基因的表達而發揮擬雌激素活性[4]。研究表明補骨脂素能促進成骨細胞增殖分化，增加成骨細胞骨保護素(OPG)的表達，抑制核因子 kB 受體激活因子配體(RANKL)的表達而抑制破骨細胞的分化和成熟，從而抑制骨吸收發揮抗骨質疏松的作用[8]。

雌激素受體有ERα和ERβ兩種亞型，在骨組織內主要是ERβ，大部分分布在胞漿中，少部分分布在細胞膜。雌激素受體與雌激素結合后，雌激素受體轉位到細胞核內調控一系列靶基因的表達。絕經后婦女的體內不僅雌激素水平大幅下降，而且組織細胞內的ER也下降[9-10]。由于ER是一種基因轉錄調控因子，其表達水平的下降必然影響到受其調控的一系列基因的表達。因此，在補充體內雌激素的同時，適當提高體內ER水平能更好地延緩絕經后骨質疏松的發展。本研究結果表明，大鼠去卵巢3個月后，其體內血清E2水平和股骨ERβ水平顯著下降。給予戊酸雌二醇能顯著提升ERβ的表達水平。壯骨止痛膠囊不僅提高去卵巢骨質疏松大鼠體內E2水平，而且促進去卵巢骨質疏松大鼠股骨內ERβ的表達。補骨脂素高劑量(8 mg/kg)也具有同時升高骨質疏松大鼠體內E2和ERβ水平的作用。補骨脂素在低劑量(4 mg/kg)時對體內E2和ERβ的調節作用沒有顯著影響。

IL-17主要由輔助性T17細胞(Th17)分泌，IL-17受體廣泛存在于人體各種組織與細胞中，包括軟骨細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞等。已有實驗證實雌激素缺乏可以上調IL-17，促進RANKL的表達和骨的重吸收，且特異性拮抗IL-17或者IL-17受體缺失的小鼠在切除卵巢后不會發生骨質疏松[11]。因此，IL-17作為Th17細胞與骨細胞之間的調節因子，可以作為抗骨質疏松藥物的一個新的作用靶點。本實驗模型組大鼠血清IL-17非常顯著升高(P<0.01)，而且股骨的IL-17基因表達也顯著增強(P<0.01)，表明去卵巢造成體內雌激素缺乏導致股骨內的T17細胞的IL-17基因表達增強，從而提高骨微環境的IL-17水平，促進破骨細胞的骨吸收。補充戊酸雌二醇則非常顯著抑制股骨內的T17細胞的IL-17基因表達，降低血清IL-17水平。補骨脂素高劑量(8 mg/kg)和低劑量(4 mg/kg)均能抑制去卵巢大鼠股骨T17細胞的IL-17基因表達和血清IL-17水平。

TNF-α是目前發現的一種強有力的骨吸收誘導劑，在雌激素缺乏的小鼠中，T細胞分泌的TNF-α通過與骨髓單核細胞表面的TNF受體結合，加強RANKL誘導的破骨細胞的形成[12]。雌激素缺乏時，激活和增殖T細胞，T細胞增多，TNF-α、等細胞因子分泌增多[13]，促進破骨細胞的形成和活化，增強破骨細胞主導的骨吸收過程。本實驗中，去卵巢模型大鼠血清TNF-α水平及股骨TNF-α基因表達升高非常顯著(P<0.01)。給予戊酸雌二醇后，去卵巢模型大鼠血清TNF-α水平及股骨TNF-α基因表達下降非常顯著(P<0.01)，這進一步證實雌激素缺乏后T細胞功能失衡在骨代謝失常中扮演了重要角色。補骨脂素高劑量(8 mg/kg)顯著降低去卵巢大鼠血清TNF-α水平(P<0.05)，同時股骨TNF-α基因表達也明顯下調(P<0.05)。

本實驗表明補骨脂素呈現明顯的量效關系提高去卵巢大鼠血清雌激素水平，同時對去卵巢大鼠TNF-α、IL-17的調節也呈現量效關系。補骨脂素在低劑量(4 mg/kg)對E2和ERβ的影響與模型組相比沒有統計學差異，但其仍然能夠抑制TNF-α、IL-17基因表達和降低血清TNF-α、IL-17水平。這種現象提示補骨脂素可能從兩個方面發揮抗骨質疏松作用：一方面補骨脂素通過調節體內雌激素和雌激素受體水平對TNF-α、IL-17基因表達進行調節，其中包括補骨脂素與雌激素受體結合；另一方面，補骨脂素可能通過其它非雌激素信號途徑調節TNF-α、IL-17基因表達。相關的具體作用細節需要借助有關轉基因實驗動物和體外細胞實驗進一步研究。