枸杞子乙酸乙酯提取物急性毒性及對切除卵巢大鼠骨質疏松的防治作用

劉舵 楊永利 雷婷 陳寶東 張勇杰 明磊國*

1.西安組織工程與再生醫學研究所，西安 710032 2.寧夏華寶枸杞產業有限公司，銀川 750001

枸杞子(Fructus lycii)為茄科植物寧夏枸杞(Lycium barbarum)的成熟干燥果實，《本草綱目》中記載枸杞具有“堅精骨”的功效，《神農本草經》中也指出枸杞久服能“堅筋骨”，因此，枸杞子對骨質疏松的治療存在一定的功效，例如枸杞中的枸杞多糖能夠治療去勢雌性大鼠的骨質疏松[1]。然而，大量研究表明中藥材中堅筋益骨的功效成分主要為黃酮類物質，如淫羊藿苷[2]、黃芪總黃酮[3]、蜂膠黃酮[4]、骨碎補黃酮[5]及大豆異黃酮[6]等。黃酮類物質被稱為植物雌激素，近年來植物雌激素對絕經后婦女骨質疏松癥的防治研究備受關注[7]。實驗所用的枸杞子乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extraction from fructus lycii， EAEF)中黃酮類物質含量較高，可能對骨質疏松有一定的治療作用。但EAEF屬于粗提物，成分復雜，需要先進行急性毒性實驗。研究中通過切除雌性大鼠卵巢復制絕經后婦女骨質疏松癥，來研究EAEF防治骨質疏松的功效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：C57/BL6小鼠40只，雌雄各半，6～8周齡，清潔級，18～22 g。雌性SD大鼠40只，6周齡，清潔級，180～260 g。均購自第四軍醫大學實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK(軍)2012-0007。

1.1.2實驗材料與藥品：寧夏枸杞(Lycium barbarum)干果(寧夏華寶枸杞產業有限公司提供)，大豆苷元(純度≥ 98%，上海源葉生物科技有限公司，批號Z27M6L1)。

1.1.3實驗儀器：旋轉蒸發儀RE-2002(鞏義 宇翔)，真空冷凍干燥器2-4 LSC(德國 BMH Instruments)，Shimadzu GC 2010氣相色譜儀(日本 島津)，紫外-可見分光光度計UV-1601(北京 瑞利)，自動組織包埋機EG1150C(德國Leica)，組織切片機RM2125(德國 Leica)，光學顯微鏡BX41(日本OLYMPUS)，Micro CT Inveon(德國 Siements)。

1.2 方法

1.2.1EAEF的制備方法：取5 000 g枸杞干果，用95%乙醇常溫浸提3次，每次3 d。合并3次提取液，旋轉蒸發儀濃縮，真空冷凍進行干燥，得乙醇提取物。乙醇提取物加入少量水分散，置于分液漏斗，再采用2倍體積的石油醚連續萃取3次，棄上層萃取液，將下層水相，加入2倍體積的乙酸乙酯，重復萃取3次，合并萃取液，于48℃下真空濃縮，真空冷凍干燥后得EAEF。氣相色譜測得溶劑乙酸乙酯殘留率為0.01%，UV測得多酚類物質含量為30.17%。

1.2.2急性毒理實驗： EAEF采用10%的DMSO玉米油溶液配制，將小鼠隨機分為1.25、2.50、5.00、10.00 g/kg劑量組及空白組，每組8只，雌雄各半，禁食不禁水。16 h后，在24 h內分4次灌胃給藥，每次間隔6 h。給藥后立即觀察動物反應，記錄飲食、排泄、精神、活動等情況，連續觀察7 d。給藥后第8 d處死并解剖，肉眼觀察觀察各臟器有無異常，并對心臟、肝臟、脾臟、肺臟及腎臟進行石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下進行病理學檢查。

1.2.3大鼠骨質疏松防治實驗：隨機取30只雌性SD大鼠，用35 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉，在無菌條件下背部(距背側下肋緣和脊柱1 cm處)雙側縱行切口，切口約1 cm，依次切開皮膚、皮下組織及肌肉，切除雙側卵巢，切口逐層縫合。隨機分為3組，即模型組、大豆苷元組和EAEF組，每組10只。其余10只大鼠為假手術組，以同樣步驟手術，但不切除卵巢。恢復5 d，將大豆苷元組腹腔注射20 mg/kg的大豆苷元，EAEF組腹腔注射125 mg/kg EAEF，假手術組和模型組腹腔注射等量的生理鹽水，每周3次，連續給藥12 w。期間觀察大鼠食欲、精神狀態和局部感染等情況。實驗結束后分離右腿股骨，進行Micro-CT掃描。選擇掃描參數：管電壓80 KV，電流 500 μA，以360°掃描角度、10.44 μm的掃描分辨率沿股骨長軸方向掃描股骨遠端，獲取掃描分辨率為21 μm連續的平面μCT圖像。掃描完成后在主機上選出生長板上1 μm和股骨遠端1.5 mm的區域作為感興趣區域(region of interest，ROI)。CT值高于1500定為骨組織，行三維重建，進行定量分析，測量如下指標：骨密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分數(bone volume fraction，BVF)、骨小梁數量(trabecular number，TN)、骨小梁間隔(trabecular spacing，TS)、骨小梁厚度(trabecular thickness，TT) 和骨表面面積比(bone surface area fraction，BSAF)。

2 結果

2.1 EAEF對急性毒性實驗小鼠一般表現與體重的影響

小鼠灌胃給藥后，自發活動有所減少，半小時后恢復正常。給藥一周內，各組小鼠活動正常，動物外觀、四肢活動、進食、呼吸及大小便均未出現異常，亦未出現死亡。實驗前各組小鼠間體重無顯著性差異(P>0.05)。一周后，各組小鼠體重均顯著增加(P<0.01)，實驗后各組小鼠間體重增長率均無顯著差異(P>0.05)。EAEF的LD50及MTD>10 g/kg，根據GB15193.3-2003中的急性毒性分級標準，表明EAEF屬實際無毒物。見表1。

表1 實驗前后各組急性毒性實驗小鼠體重(n=8，g)Table 1 Body weights of the mice in the acute toxicity experiment (n=8,g)

2.2 EAEF對急性毒性實驗小鼠臟器的影響

7天后，處死解剖，觀察其內臟顏色、光澤、形態、大小等，均未見異常。對心臟、肝臟、脾臟、肺臟及腎臟進行病理學檢查，各實驗組小鼠內臟組織結構排列有序，細胞大小、形態正常，胞漿、胞核染色清晰，未見明顯異常(圖1)。說明EAEF的經口急性毒性不明顯，在一定范圍的應用是安全可靠的。

圖1 各組急性毒性實驗小鼠各主要臟器HE染色圖(400×)。A：心臟；B：肝臟；C：脾臟；D：肺臟；E：腎臟 Fig.1 HE staining of the main organs of mouse for acute toxicity experiment (400×). A: Heart; B: Liver; C: Spleen; D: Lung; E: Kidney.

2.3 EAEF對切除卵巢大鼠體重的影響

實驗前各組大鼠間體重無顯著性差異(P>0.05)，實驗后各組大鼠體重比實驗前均有極顯著增加(P<0.01)，各組大鼠間體重增長率均無顯著性差異(P>0.05)，見表2。

表2 實驗前后各組骨質疏松實驗大鼠體重(n=10，g)Table 2 Body weights of the rats in the osteoporosis experiment (n=10,g)

2.4 EAEF對切除卵巢大鼠股骨遠端松質骨骨小梁微觀結構的影響

與假手術組相比，模型組大鼠股骨遠端松質骨的骨小梁結構均較為纖細且疏松，厚度較薄，結構退化最為嚴重，大豆苷元組、EAEF組的骨小梁結構退化不及模型組明顯，可以初步得出，EAEF對去勢大鼠骨質疏松有一定的防治作用(圖2)。

圖2 各組骨質疏松實驗不同組Micro-CT圖片。A：股骨縱剖圖；B：股骨ROI區橫截面；C：股骨ROI區3D模型 Fig.2 Micro-CT images of different groups in the osteoporosis experiment. A: Longitudinal profiles of the femurs; B: Cross sections in ROI area of the femurs; C: 3D models in ROI area of the femurs.

2.5 EAEF對切除卵巢大鼠股骨遠端骨質相關參數的影響

與假手術組相比，模型組BD有顯著降低(P<0.05)，大豆苷元組和EAEF組均有一定程度的恢復，且大豆苷元組與模型組存在顯著差異(P<0.05，圖3A)。與假手術組相比，模型組BVF、TN顯著降低(P<0.05)，大豆苷元組和EAEF組均有一定程度的恢復，且與模型組均有顯著差異(P<0.05，3B、3C)。與假手術組相比，模型組TS增大極顯著(P<0.01)，大豆苷元組和EAEF物組均有一定程度的恢復，且大豆苷元組與模型組存在顯著差異(P<0.05，圖3D)。與假手術組相比，模型組TT有所減小，大豆苷元組和EAEF組均有一定程度的恢復，各組間均無顯著差異(P>0.05，圖3E)。與假手術組相比，模型組BSAF有所增加，大豆苷元組和EAEF組均有一定程度的恢復，各組間均無顯著差異(P>0.05，圖3F)。

3 討論

骨質疏松是一種伴隨著骨量降低和骨微觀結構退化的系統性骨骼常見多發病[8]。絕經后婦女骨質疏松發病率很高，據調查70歲以下婦女絕經后骨質疏松癥的發生率為30%左右，至80歲時40%的婦女發生過骨折[9]。骨質疏松發生過程中，骨結構中的骨小梁的變化表現為骨小梁變細，最終使松質骨的穩定性和力學強度等生物力學性能減退[6]。有研究者認為骨結構的退化對骨的整體性能通常比骨量的減少更具危害性[10]，因此通過藥物干預保護骨的微觀結構，使骨微觀結構增強是骨質疏松治療的重要方向之一。目前切除卵巢大鼠建立骨質疏松模型來研究絕經后婦女骨質疏松已經成為經典模型[11]，實驗中也采用切除卵巢大鼠來建立骨質疏松模型。

圖3 骨質疏松實驗不同組松質骨微結構參數(n=10)。A：各組BD；B：各組BVF；C：各組TN；D：各組TS；E：各組TT；F：各組BSAF。*：P≤0.05，**：P≤0.01Fig.3 Trabecular microstructure parameters of different groups in the osteoporosis experiment (n=10).A: BD in each group; B: BVF in each group; C: TN in each group; D: TS in each group; E: TT in each group; F: BSAF in each group.*：P≤0.05，**：P≤0.01.

目前，研究者們通過不同工藝流程提取得到的EAEF成分不盡相同，功效也不盡相同，張麗等人[12]發現EAEF具有良好的抗氧化活性，徐飛等人[13]在EAEF中分離得到了黃酮類物質槲皮素單體。實驗中EAEF溶劑乙酸乙酯殘留率為0.01%，其值遠低于中國藥典(2010年版)中乙酸乙酯的殘留標準0.5%。EAEF的LD50及MTD>10 g/kg，屬實際無毒，其在一定濃度范圍內應用是相對安全可靠的。實驗中所用的EAEF中多酚類物質含量30.17%，其中包含較多的黃酮類物質，對骨質疏松具有一定的防治作用。大豆異黃酮是典型的植物雌激素，能同時作用于成骨細胞和破骨細胞，發揮協調作用，大豆苷元是大豆異黃酮的主要成分之一，能改善去卵巢小鼠的皮毛蓬松、行動遲緩、反應遲鈍和精神不振等癥狀，增加去卵巢小鼠的子宮重量系數、骨小梁分布密度和骨皮質厚度，還能通過調節OPG/RANKL比例調節骨重建過程中成骨細胞和破骨細胞的平衡，具有良好的抗骨質疏松作用[14]，在實驗中作為了陽性藥物。實驗發現，大豆苷元組、EAEF組的大鼠股骨TN、TT、BVF和BD相對模型組增加，而TS和BSAF相對模型組減小，微觀結構有所改善，減緩因絕經導致的骨微觀結構退化，對骨質疏松具有一定的防治作用。此實驗為進一步深入研究開發治療骨質疏松的藥物提供實驗基礎，并為有針對性的開發利用寧夏枸杞中的活性成分提供理論依據。實驗中僅僅使用EAEF進行試驗，黃酮類物質含量較高，但無法排除其中的其他物質也對骨質疏松有治療作用。下一步，還需要對其中的成分進一步分離純化，設定一定的劑量梯度進行實驗。另外，EAEF防治骨質疏松的機制目前還不清楚，有待于進一步深入的研究。