壯骨方對糖尿病大鼠骨質疏松的防治及其對血清IGF-1、TNF-α水平的影響

粟麟 李雙蕾 陳文輝 馬汝潔 莫文秋

1. 廣西中醫藥大學研究生院，南寧 530001 2. 廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530001 3. 要江蘇連云港市贛榆區中醫醫院，連云港 222100

糖尿病性骨質疏松癥(diabetic osteoporosis，DOP)是因糖尿病(diabetes mellitus，DM)高血漿葡萄糖水平的內環境下并發的骨吸收與骨形成失衡致使骨量減少、骨顯微結構受損、骨強度降低，骨折風險增加[1]。中醫認為DOP屬于“骨痿”、“骨痹”等范疇，病位在腎，與肝、脾密切相關聯，性屬本虛標實，其主證為腎虛脾虧、脈絡瘀阻。其治療規律不同于一般骨痿，應以消渴為本，骨痿為標。壯骨方以補腎壯骨、益氣健脾、活血通絡佐益氣養陰為法，在骨痿病性的基礎上兼顧消渴氣陰兩虛的特點。經臨床觀察對2型糖尿病合并骨質疏松癥具有較好的療效[2]，但對其療效的現代機制研究尚不足。胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor，IGF-1)是促細胞分化增殖作用以及刺激后成骨細胞分化增強的因子，在促進成骨細胞生成、分化、增強其活性方面具有重要作用[3-4]；腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor，TNF-α)作為重要的炎性因子，介導炎性過程導致骨量丟失，起著關鍵性作用而受到研究者們的關注[5]。本研究通過動物實驗從血清IGF-1、TNF-α表達水平等方面探討壯骨方防治DOP的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級雄性SD大鼠70只，體重(161±6.56)g，實驗動物許可證號：SCXK桂2009-0002，大鼠飼養于廣西中醫藥大學實驗動物中心動物房，室溫25℃～28℃，通風，自然采光，大鼠自由進食、飲水。所有實驗動物飼料均由廣西中醫藥研究所提供。

1.2 主要試劑和儀器

酶聯免疫吸附法(Elisa)檢測試劑盒(蘇州卡爾文生物科技有限公司)；血糖儀(德國羅氏血糖儀公司)；Discovery-A型雙能X線吸收骨密度儀(美國HOLOGIC公司)；倒置顯微鏡、半自動圖像數字化分析儀(日本OLYMPUS公司)；酶標儀(芬蘭Labsystems Multiskan)。

1.3 藥品

壯骨方(淫羊藿、枸杞、黃芪、骨碎補、杜仲、牛膝、山藥、白術、丹參、田七、甘草組成，采用江陰天江藥業有限公司生產的單味中藥濃縮顆粒劑)；鹽酸二甲雙胍片(江蘇蘇中海欣制藥有限公司生產，批準文號：國藥準字H32021625；生產批號：12123012)；鏈脲佐菌素(美國sigma化學制劑公司)；水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.4 方法

1.4.1動物模型建立：適應性喂養1周后，隨機將70只大鼠分為空白組(Blank 10只)、造模組(60只)。造模組給予高脂飼料，空白組給予普通飼料，喂養4周后，予以禁食12 h，造模組一次性腹腔注射2%STZ(35 mg/kg)，空白組腹腔等量注射0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液。72 h后斷尾取血測定空腹血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol/L視為2型糖尿病大鼠模型造模成功，共54只大鼠造模成功。

1.4.2動物分組及給藥方法：隨機挑選50只2型糖尿病造模成功大鼠隨機分為5組：模型組(DM)、二甲雙胍組(DM+MET)、壯骨方低劑量組(DM+MET+ZGF-L)、壯骨方中劑量組(DM+MET+ZGF-M)、壯骨方高劑量組(DM+MET+ZGF-H)，各10只。DM+MET組用鹽酸二甲雙胍片以157.5 mg/kg用蒸餾水溶解灌胃。壯骨方3個劑量組在與DM + MET組使用同等劑量鹽酸二甲雙胍灌胃的基礎上分別以壯骨方高、中、低劑量灌胃，其中不同劑量組別分別含生藥3 g/ml、1.5 g/ml、0.75 g/ml。空白組及模型組等量蒸餾水灌胃。各組大鼠灌胃量均為1.5 ml/100 g，2次/天，灌胃后正常進食，經以上處理12周。

1.5 檢測指標

1.5.1血清檢測：分別于給藥后第4、8、12周，麻醉下眶緣靜脈取血，室溫靜置后離心(3000 r/10 min)分離血清，用酶聯免疫吸附法(Elisa法)測定血清IGF-1、TNF-α水平，按Elisa試劑盒說明書操作。

1.5.2骨密度(BMD)測定：由廣西壯族自治區人民醫院骨密度室專業人員操作完成，采用美國HOLOGIC公司Discovery-A型雙能X線吸收骨密度儀，掃描軟件為小動物軟件(版本：3.9.4)，測量條件為：掃描速度60 mm/s，測定面積0.24 cm2。

1.5.3骨形態學及骨計量單位測定：給藥后第12周，麻醉下腹主動脈取血處死大鼠，冰上剝離動物右側后肢脛骨，剔除所有筋膜、軟組織，用低速鋸取上段備用。置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，放入7%EDTA脫鈣2周，流水沖洗24 h，乙醇中逐級脫水，正丁醇過夜，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片(5 μm)，使用圖像分析系統測量以下參數：骨小梁面積(Trabecular Bone Area，Tb.Ar)；骨小梁周長(Trabecular Surface，Tb.Pm)；骨小梁面積百分比(Percent Trabecular Area，%Tb.Ar)；骨小梁數量(Trabecular Number，Tb.N)；骨小梁分離度(Trabecular Separoation，Tb.Sp)。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 血糖

給藥后對各組的FBG水平監測顯示(表1)，DM組血糖水平明顯高于其他各組，壯骨方治療組與二甲雙胍組均可降低血糖(P<0.01)。壯骨方治療組與二甲雙胍組相比在第4周、第8周血糖水平無明顯差異(P>0.05)，但是第12周壯骨方高劑量組FBG水平低于同期單純二甲雙胍治療組(P<0.01)。

表1 壯骨方對2型糖尿病大鼠FBG水平的影響Table 1 Effect of ZGF on FBG in type

注：與空白組比較：○P<0.05，●P<0.01；與模型組比較：△P<0.05，▲P<0.01；與二甲雙胍組比較：☆P<0.05，★P<0.01

2.2.1給藥12周后骨密度結果：給藥12周后，給藥后對各組的骨密度檢測顯示(表2)，DM組骨密度值(0.1496±0.0061)g/cm2低于空白組(0.1796±0.0072) g/cm2，P<0.01；壯骨方治療組骨密度值均高于模型組(P<0.01)，且呈劑量依賴性，其中低劑量組骨密度值為(0.1628±0.0057) g/cm2，中劑量組骨密度值為(0.1665±0.0052)g/cm2，高劑量組骨密度值為(0.1745±0.0062)g/cm2；二甲雙胍組骨密度值(0.1590±0.0055) g/cm2高于模型組(P<0.05)。壯骨方高劑量組骨密度值高于單純二甲雙胍組(P<0.01)。

2.2.2給藥12周后骨形態計量學靜態參數結果：給藥12周后，DM組Tb.Ar、Tb.Pm、%Tb.Ar、Tb.N明顯下降，Tb.Sp增加(P<0.01)，壯骨方3個劑量組與二甲雙胍組Tb.Ar、Tb.Pm、%Tb.Ar、Tb.N水平明顯增加(P<0.01)；其中壯骨方高劑量組、中劑量組Tb.Ar、%Tb.Ar水平較二甲雙胍組增加(P<0.05)；高劑量組Tb.Pm、Tb.N水平較二甲雙胍組增加(P<0.05)，骨小梁分離度各組之間比較無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 給藥12周后各組骨形態計量學靜態參數結果Table 2 The result of bone histomorphometry parameters in each group after the treatment for 12 weeks n=10)

注：與空白組比較：○P<0.05，●P<0.01；與模型組比較：△P<0.05，▲P<0.01；與二甲雙胍組比較：☆P<0.05，★P<0.01

2.3 血清IGF-1、TNF-α

第4、8、12周監測各組大鼠血清IGF-1(表3)、TNF-α(表4)水平后顯示，治療組較DM組血清IGF-1水平增高、TNF-α水平降低(P<0.01)，但比較各治療組之間顯示：壯骨方高、中劑量治療組較二甲雙胍組血清IGF-1水平增高、TNF-α水平降低(P<0.01)，壯骨方低劑量組與二甲雙胍組之間比較無顯著性差異(P>0.05)。

表3 壯骨方對2型糖尿病大鼠血清IGF-1的影響Table 3 Effect of ZGF on serum IGF-1 in type 2 diabetic rats n=10)

注：與空白組比較：○P<0.05，●P<0.01；與模型組比較：△P<0.05，▲P<0.01；與二甲雙胍組比較：☆P<0.05，★P<0.01

表4 壯骨方對2型糖尿病大鼠血清TNF-α的影響Table 4 Effect of ZGF on serum TNF-α in type 2 diabetic rats n=10)

注：與空白組比較：○P<0.05，●P<0.01；與模型組比較：△P<0.05，▲P<0.01；與二甲雙胍組比較：☆P<0.05，★P<0.01

3 討論

DOP獨特病理內環境增加了合并慢性炎癥的風險和(或)炎癥嚴重程度[6]，使骨礦物丟失增加[1]。Verhaeghe J等研究發現糖尿病大鼠血清1,25(OH)2D3結合蛋白顯著下降，十二指腸鈣吸收障礙，脛骨骨小梁數量下降44%，成骨細胞及其前體減少10%[7]。通過誘導大鼠產生2型糖尿病，通過雙能X線吸收骨密度儀檢測發現糖尿病模型組BMD較其他各組下降(P<0.05)，并對造模成功的DM大鼠脛骨組織切片通過半自動圖像數字化分析儀觀測到DM組大鼠較空白組大鼠骨小梁數量下降33%，小梁面積和周長減小(P<0.05)，確定2型糖尿病大鼠骨質疏松形成。

壯骨方(淫羊藿、枸杞、黃芪、骨碎補、杜仲、牛膝、山藥、白術、丹參、田七、甘草等)中以淫羊藿溫補腎陽，枸杞滋補腎陰，黃芪益氣健脾用為君藥，三藥組合，陰陽雙補，使腎精充沛，脾氣健運，補益先天，調補后天。針對消渴并骨痿脾腎虧虛的根本病機發揮作用。研究發現，骨碎補總黃酮能增強成骨細胞活性與分化，另一方面調節下丘腦-垂體-性腺軸功能，提高體內雌激素水平，降低甲狀腺激素水平，促進腸鈣吸收和骨鈣沉積[8]。此外Yin等[9]研究發現骨碎補苷具有降低核因子-κB及其受體激活劑(receptor activator of nuclear factor-κB-ligand，RANKL)表達抑制破骨細胞活性的作用。淫羊藿苷有通過增加TNF受體家族之一的骨保護素(OPG)mRNA的表達而使核因子-κB受體RANKL受到競爭性抑制，進一步阻礙破骨細胞分化和成熟，抑制骨吸收[10]。高血糖使炎性因子及RANKL表達增多，OPG表達下降。實驗證實壯骨方高、中劑量組較二甲雙胍組血清TNF-α、FBG水平顯著下降，但低劑量組與之相比無明顯差異，由此推測壯骨方呈劑量依賴性通過降低血漿葡萄糖水平與其中所含淫羊藿苷使OPG表達增多競爭性結合TNF-α因子使血清TNF-α水平有關；骨碎補總黃酮及骨碎補苷增強成骨細胞活性、促進腸鈣吸收，抑制破骨細胞分化、成熟，抑制骨破壞。

研究發現，糖尿病患者即使骨量、骨密度正常或升高也因IGF-1水平下降而致使骨折風險增加[11]，因此IGF-1成為評估骨質疏松和骨折風險的因素之一[12]。IGF-1由肝細胞合成和釋放，與其受體IGF1R在調控蛋白的作用下分布于血清入循環和局部骨組織而發揮其活性，在骨結構形成過程中調控軟骨細胞的肥大促進縱向骨生長[13]，同時也直接或間接介導體循環中生長激素而促進成骨細胞的增殖、分化和骨結構的形成[14-15]。近年來研究者們通過直接補充人重組IGF-1或間接升高體內IGF-1水平的方式達到控制骨重吸收，抑制骨量減少，增加骨強度降低骨折風險等目的[16-18]。筆者通過監測給藥過程中各組血清IGF-1，發現壯骨方高、中劑量治療組IGF-1水平明顯高于二甲雙胍組，結合其骨計量參數結果，推斷壯骨方可能通過升高機體內血清IGF-1水平而維持骨微結構，且這種作用呈現出劑量依賴性。

通過動物實驗，得出壯骨方防治2型糖尿病骨質疏松的可能機制為通過降低血糖、升高血清IGF-1、降低血清TNF-α水平促進骨形成抑制骨吸收。但是其作用表現出劑量依賴性，提示進一步進行藥物最大有效量及相關藥物毒理研究。隨著細胞分子研究的開展，壯骨方對成骨細胞及破骨細胞的作用信號通路仍有待探明。