不同劑量辛伐他汀載藥體系對兔骨質疏松模型骨修復的實驗研究

鄒偉龍 于龍 王亮 李大偉， 羅展鵬， 補亞忠 楊飛 馬遠征*

1. 南方醫(yī)科大學， 廣州 510515 2. 解放軍第309醫(yī)院，北京 100091 3. 中國科學院化學研究所高分子物理與化學國家重點實驗室，北京 100190

骨質疏松癥已經成為人類最常見的骨骼疾病之一，其發(fā)病率隨著年齡增長而提高，隨著我國人口老齡化加劇，骨質疏松伴病理性骨折、脊柱退行性疾病等需要手術的患者越來越多，為骨組織工程學的發(fā)展提出新的挑戰(zhàn)。我國50歲以上人群中患骨質疏松(Osteoporosis，OP)近7000萬，其中女性脊柱OP發(fā)病率高達28%[1]，目前每年新發(fā)OVCF約181萬例，預計2020年OVCF患者高達3675萬人[2]。磷酸鈣生物材料[3]具有生物相容性好、可降解等優(yōu)點，然而，磷酸鈣生物材料只具有骨傳導性，缺乏骨誘導的特性，降解速率緩慢，為了提高材料降解率及成骨活性，研究者們曾嘗試將磷酸鈣生物材料作為重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2或藥物緩釋載體進一步誘導成骨發(fā)生[4]。辛伐他汀(Simvastatin，SIM)是一種常用的降脂藥物，1999年Mundy等[5]發(fā)現(xiàn)他汀類藥物能促進嚙齒類動物骨形成、刺激成骨細胞分化。基于以上研究基礎，本研究擬建立一種可注射、可降解及抗骨質疏松的SIM-聚左旋乳酸(Poly-L-Lactic Acid，PLLA)藥物緩釋體系，主要討論SIM-PLLA緩釋體系的可注射性、凝固時間、力學強度、藥物釋放規(guī)律、生物相容性及骨質疏松模型兔體內實驗。

1 材料與方法

1.1 材料

磷酸鈣生物材料(上海瑞邦生物材料有限公司)、辛伐他汀(美國sigma)、聚左旋乳酸(PLLA分子量為10萬，中國科學院化學研究所)、新西蘭大白兔(解放軍309醫(yī)院動物實驗中心提供)。

1.2 SIM-PLLA載藥緩釋體系的制備

1.2.1載藥微球的制備：采用膜乳化法制備。(1)取300毫克PLLA(分子量為10萬)在10毫升三氯甲烷中溶解過夜，另取2克聚乙烯醇(PVA)在198克水中溶解過夜。(2)將過夜的PVA水溶液用離心機離心除去其中的不溶物。(3)取25毫克SIM溶于3毫升水中，然后和溶解過夜的PLLA溶液混合，放置于超聲儀器下超聲20秒后形成乳濁液。將形成的乳濁液倒入離心后的PVA溶液中，用膜乳化機，在0.08MPa的壓力下，采用7微米的膜過4次膜。(4)將過膜后的體系離心，并用水洗滌3次，然后用冷凍干燥機進行干燥，最終得到粒徑為1～2微米的微球。Co60照射滅菌封存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SIM-PLLA緩釋體系復合材料配制及分組：實驗材料共分為三組進行研究，分別為對照組(單純磷酸鈣組)、低劑量SIM-PLLA緩釋組(0.5 mg辛伐他汀)及高劑量SIM-PLLA緩釋組(1 mg辛伐他汀)。采用干態(tài)混合法將不同載藥量(0.5 mg及1.0 mg SIM)的SIM-MBG微球與磷酸鈣固相粉劑混合，對照組不加入載藥微球，獲得多功能載辛伐他汀緩釋粉劑；按固相粉末與液相的比例2.8g/ml，調和形成糊狀物，置入事先定制好的圓柱體模具中(直徑6 mm，高度10 mm)，于37℃，100%相對濕度的溫箱中固化24 h，獲得的三組材料用Co60照射滅菌封存待用。

1.3 方法

1.3.1體外SIM-PLLA載藥緩釋體系理化性質測定：(1)注射性能檢測：用一次性注射器測定，分別在粉末和液相混合2、4、8、16 min后，置于AGS-X系列電子萬能試驗機(日本島津公司)測試，速率15 mm/min推出復合材料，稱量壓出前后復合材料漿液的重量，注射性(%)=(推出泥漿重量/注射前的泥漿重量)×100%，對照組、低劑量SIM-PLLA緩釋組及高劑量SIM-PLLA緩釋組3種材料分別測量10次，取平均值[6]。(2)凝固時間：凝固時間的測定采用ISO5833標準稠度凝結時間測定儀(河北省虹宇儀器設備有限公司產品)。將終凝用試針垂直放在材料表面，停留5 s，每隔30 s重復1次， 至終凝用試針針頭在材料表面未能留下圓形痕跡。從開始混合到終凝用試針針頭不能在材料表面留下圓形痕跡的時間為復合材料的固化時間，每種材料測定10次，取平均值。(3)力學強度：用模具制作直徑6 mm、高度10 mm的標準材料試件，根據(jù)ISO 5833國際標準，檢測材料的壓縮強度。采用AGS-X系列電子萬能試驗機(日本島津公司)進行壓縮實驗，儀器最大靜載荷：±500N；返回速度：1500 mm/min；數(shù)據(jù)采樣間隔：1 ms；加載速度0.01 mm/s。分別在試件固化1d和7d測量，每種材料試件重復測量10次，取平均值。

1.3.2SIM-PLLA微球體外藥物釋放規(guī)律：稱量含50 mg微球的復合材料放置于透析袋中；將透析袋放入50 mL PBS溶液中，在37℃下釋放；在時間點1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、10 d、15 d、20 d、25 d取3 mL釋放介質，同時加入3 mL PBS溶液；用紫外可見分光光度計對取出的釋放介質進行測量，并根據(jù)標準曲線計算結果。

1.3.3動物實驗：(1)骨質疏松模型的建立按張堃[7]等的方法建立兔骨質疏松模型，在解放軍309醫(yī)院實驗動物中心購置5個月齡新西蘭母兔，動物房中適應2周后，在速眠新(2.5 mg/kg)麻醉下行雙側卵巢切除術，術畢予預防感染，術后1W予肌肉注射地塞米松0.5 mg/kg，2次/W，共注射8w。(2)動物分組及SIM-PLLA載藥緩釋材料的植入：在成功建立骨質疏松模型母兔中隨機選擇36只，隨機分為3組，按植入材料的不同，分為對照組，低劑量組和高劑量組。麻醉后在無菌條件下于股骨髁部切開皮膚、逐層分離暴露股骨髁骨質，用電鉆開出直徑6 mm、深度10 mm的圓柱狀骨缺損，分別植入材料，逐層閉合傷口，術后預防感染。(3)Micro-CT分析：在術后4、12周兩個時間點每組分別隨機處死6只兔子，取出股骨后立即用福爾馬林固定，進行Micro-CT掃描，通過分析軟件得出標本中剩余材料的體積比(residual material volume fraction，RMVF)和新骨長入的體積分數(shù)(bone volume fraction，BVF)，RMVF=(剩余材料體積/原材料體積)×100%，BVF=(長入骨體積/原材料體積)×100%，4w、12w每個時間點每組6個標本，取平均值。

1.3.4統(tǒng)計學分析：采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體外SIM-PLLA載藥緩釋體系理化性質測定

可注射性能、凝固時間及力學強度檢測。圖1、表1表示復合緩釋材料在37℃、100%濕度條件下可注射性及凝固時間的表現(xiàn)。圖2表示復合緩釋材料壓縮強度的表現(xiàn)。

圖1 可注射性能與對照組比較,*P<0.05Fig.1 Injectable performanceCompared with control group,*P<0.05

由圖1可見，前4min時，對照組和含PLLA微球組的注射性能無明顯差異，8min后，含PLLA微球組可注射性均大于對照組，注射性有所改善，未見復合骨水泥材料出現(xiàn)固液分離現(xiàn)象，三組材料間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而含微球組高低劑量組間的比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

由表1可見，對照組和兩個含PLLA微球組比較，微球組凝固時間延長，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

由圖2可見，各材料組力學強度在1d、7d時間點，各組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表1 凝固時間Table 1 The setting time

2.2 藥物釋放檢測

由圖3可見，SIM-PLLA微球在前5天時間里有明顯的突釋現(xiàn)象，第10天后，釋放率達(51.25±4.35)%，10天以后SIM-PLLA微球藥物緩釋平穩(wěn)，直到25天時達到(69.75±4.79)%。

圖3 藥物釋放曲線Fig.3 Drug release curve

2.3 動物在體實驗結果

由圖4、5可見各組材料植入兔股骨髁后標本中剩余材料的體積比(RMVF)和新骨長入的體積分數(shù)(BVF)，圖6示 Micro-CT三維重建圖及截面重建圖：可見三組材料均出現(xiàn)隨植入4w、12w時間推移材料進一步降解，新生骨逐漸長入的情況，但單純磷酸鈣材料組在植入4w和12w后三維及橫截面重建的影像圖無明顯變化，僅在材料的邊緣可見少量新生骨長入，低劑量SIM-PLLA緩釋材料組隨著植入時間從4w延長至12w，材料逐漸發(fā)生降解，4w時已可見新生骨呈星點狀從材料外周長入材料內，12w時材料降解進一步增加，可見更多新骨長入材料內部。高劑量組與低劑量組材料比較，上述隨時間變化的趨勢更加明顯，新生骨長入量及材料的降解率最高。

圖4 剩余材料體積比與對照組比較，*P<0.05低劑量與高劑量組比較，**P<0.05Fig.4 RMVFCompared with control group，*P<0.05 Comparison between low dose and high dose group，**P<0.05

圖5 新骨長入體積分數(shù)與對照組比較，*P<0.05 低劑量與高劑量組比較，**P<0.05Fig.5 BVF，Compared with control group，*P<0.05 Comparison between low dose and high dose group，**P<0.05

圖6 Micro-CT三維重建圖及截面重建圖Fig.6 Micro-CT 3D reconstruction and cross-sectional reconstruction

3 討論

SIM是一種廣泛應用于臨床的降脂藥物，但其在骨代謝方面的作用成為近年來的研究熱點[8-9]。J. Pagkalos等的研究發(fā)現(xiàn)SIM有明顯的成骨性，其通過使成骨細胞高表達BMP-2和VEGF發(fā)揮作用[10-11]。SIM也被用于骨質疏松動物模型中，發(fā)現(xiàn)其可使去勢小鼠的骨密度提高[12]。骨修復過程涉及到骨髓、骨皮質、骨膜及組織間隙精細配合，許多細胞信號分子可促使骨祖細胞遷徙到骨損傷部位并分化為成骨細胞，骨修復過程中，組織內新生血管的形成起到不可或缺的作用，VEGF不僅是血管形成的重要因子，其在軟骨細胞的增生及礦化、成骨細胞分化等方面也發(fā)揮作用。研究表明VEGF的表達與SIM呈濃度相關性，隨著SIM濃度增加，VEGF呈高表達[13-14]。然而，目前的臨床研究中，SIM經過口服全身用藥，有時并不能達到期望的功效。S. Patil[15]進行了一項涉及62人骨折治療的臨床試驗，試驗組每天口服SIM 20mg，共12w，骨折處愈合情況與安慰劑組比較無統(tǒng)計學差異，S. Patil認為口服SIM經過肝臟等代謝后濃度大大降低，到達骨組織的藥量及濃度有限，口服辛伐他汀生物利用率較低。這提示通過一種能持續(xù)局部藥物緩釋的載藥系統(tǒng)，將使SIM發(fā)揮骨誘導及抗骨質疏松方面的優(yōu)勢。

自固化磷酸鈣生物材料是一種由磷酸鈣粉末和固化液混合形成的骨組織材料，固液相混合后可有一定的操作時間，根據(jù)骨缺損區(qū)需要自由塑形，之后可常溫下凝固，并且整個過程中不產生熱量，具有良好的生物相容性、骨傳導性、可降解性等特點。臨床上被廣泛用于骨缺損區(qū)的修復，也可用于骨質疏松性骨折的治療[16]，為了克服單純材料缺乏骨誘導性及降解速率過慢等缺點，滿足多種臨床應用的需要，成為骨缺損修復的理想材料[17]，國內外學者采用復合材料的方法對其進行改性[18]。聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)屬聚酯類高分子，是迄今為止應用最廣泛的生物可降解材料，聚左旋乳酸(PLLA)是由L-乳酸構建而成的聚合物，其降解產物能被人體完全代謝，Khojasteh A[19]在PLLA生物支架中培養(yǎng)人前磨牙牙髓干細胞，發(fā)現(xiàn)PLLA材料能為細胞提供良好的支架，并誘導向成骨細胞分化，因此作為植入材料更具有優(yōu)勢，其獲得FDA認證并在醫(yī)藥行業(yè)廣泛應用，已被用來制作藥物緩釋微球[20-23]，張郝宣學者們通過合成負載SIM-PLGA藥物緩釋微球，制成大孔隙率的磷酸鈣支架，組織相容性好，在骨缺損修復方面取得較好效果，但材料力學強度較低，且體內骨缺損修復并未在骨質疏松動物模型中進行，不能驗證其SIM載藥微球在病理狀態(tài)下促進骨重建、改善骨代謝的效果[23]。本實驗成功制備SIM-PLLA微球并將其復合予磷酸鈣基體中構建了SIM-PLLA緩釋載藥體系，凝固時間比單純磷酸鈣材料固化時間稍有延長，而材料通過注射器使用時，無固液分離現(xiàn)象，力學強度與對照組比較無差異，提示復合SIM-PLLA微球后對自固化磷酸鈣生物材料理化性能影響不大，可獲得更充分的操作時間。

PLLA微球具有合成簡單、生物相容性好等優(yōu)點，載藥微球具有一定的初始抗壓強度，而PLLA微球降解后可為成骨細胞和營養(yǎng)成分及體液提供孔隙空間，有助于新生骨長入、營養(yǎng)成分及代謝廢物的輸送。PLLA微球表面有許多小孔隙可讓SIM藥物部分釋放，而隨著PLLA微球的逐步降解，微球內部的藥物得以全部緩釋出來，使SIM在局部持續(xù)逐步釋放，可充分發(fā)揮其骨誘導作用，改善局部骨組織代謝，進一步實現(xiàn)靶向抗骨質疏松作用[24-26]，SIM負載于PLLA緩釋微球中更能避免骨組織局部藥物濃度過高，減少高濃SIM聚集引發(fā)的炎癥反應[27]。本研究可見SIM-PLLA微球在前5天時間里有一定的突釋現(xiàn)象，第10天后，釋放率達(51.25±4.35)%，10天以后SIM-PLLA微球藥物緩釋平穩(wěn)，直到25天時達到(69.75±4.79)%。提示將SIM載入PLLA后，可通過PLLA的逐漸降解達到SIM局部長期緩釋。

本研究通過加入負載SIM的PLLA微球到到磷酸鈣生物材料中，植入骨質疏松模型兔的股骨髁內來探索SIM-PLLA緩釋體系體內成骨及抗骨質疏松效果，復合載藥緩釋體系組降解率和新骨生成率較對照組均顯著提高。Micro-CT結果表明，低、高劑量組植入4周及12周后材料降解及新骨形成均顯著改善，且隨著植入時間延長，材料降解率及新骨形成均明顯提高，SIM-PLLA載藥緩釋體系組的材料降解速率及新骨形成率均明顯優(yōu)于單純磷酸鈣組，其中高劑量SIM-PLLA載藥緩釋體系降解速率及新骨生成率最高，達到材料降解與新骨形成的動態(tài)平衡，作用機制考慮與以下方面有關：PLLA微球降解后可在磷酸鈣表面形成孔隙，增加了材料比表面積，可增加材料與周圍更多的骨組織及體液接觸，加速材料降解及新生骨長入；另外，SIM在這個過程中一方面可發(fā)揮其骨誘導作用，使骨組織的爬行替代過程加速，而另一方面，BMP2、VEGF因子上調促進新骨組織及新生血管的形成進一步加速了材料的降解及新生骨長入[24, 26]，提示SIM藥物緩釋體系具有明顯的成骨活性及抗骨質疏松的作用，SIM-PLLA藥物緩釋體系在骨質疏松模型兔中能改善局部骨代謝情況，達到更好的骨修復效果，為驗證該機制有待于進一步的實驗研究。

4 結論

本實驗通過將SIM-PLLA緩釋微球與磷酸鈣基體復合構建的SIM-PLLA-藥物緩釋體系具有良好的生物相容性好、可注射性能及合適的力學強度，對兔骨質疏松模型有明顯的成骨活性及抗骨質疏松效果，有望成為治療骨質疏松性壓縮骨折及不規(guī)則骨缺損的新型生物復合材料。