富血小板血漿聯合骨髓間充質干細胞對兔股骨頭壞死BMP-2/Smads通路的影響

張波 韋冰丹 甘坤寧 崔向榮 熊凱

南寧市第二人民醫院創傷骨科手外科，廣西 南寧 530031

股骨頭壞死是由于股骨頭血液供應破壞或骨細胞死亡引起的病理過程，病變可導致關節軟骨破壞、股骨頭塌陷及髖關節功能喪失等病情[1]。股骨頭壞死后期病情致殘率高，嚴重影響患者的健康水平和生活質量。近年研究表明，非創傷性股骨頭壞死股骨頭局部BMP的表達過低，這可能是影響壞死骨修復與重建的重要原因。富血小板血漿(PRP)及骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有修復軟組織功能和分化為骨細胞、軟骨細胞等功能[2]。本研究富血小板血漿聯合骨髓間充質干細胞基于BMP-2/Smads信號通路對兔股骨頭壞死的影響，為其進一步研究開發提供科學的基礎數據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

新西蘭大白兔，SPF級，雌雄各半，體重2.6～3.2 kg，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，試驗動物生產許可證SCXK(桂)2011-0003，試驗動物合格證SCXK(桂)2011-0005。將新西蘭大白兔隨機分為：空白組、模型組、PRP(3%)組、BMSCs(1×106/mL)組、PRP(3%)+ BMSCs(1×106/mL)組，每組10只。

圖1 組織HE染色結果(×200)Fig.1 The results of HE staining (×200)HT6SS〗A：空白組 B：模型組 C：PRP組 D：BMSCs組 E：PRP + BMSCs組A: normal group; B: model group; C: PRP group; D: BMSCs group; E: PRP + BMSCs group

1.2 儀器與試劑

H-DMEM培養基：北京索來寶，批號：Lot.No.20140516；標準胎牛血清：賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司，批號：NWJ1473；胰蛋白酶：北京索來寶，批號：Lot.No.20140702；BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2抗體：武漢博士德生物工程公司；大腸桿菌內毒素：Sigma 公司，批號：L-2630；垂直電泳儀、轉膜及顯影設備：BIO-RAD公司；酶免分析儀：美國Thermo Forma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1PRP制備：兔股靜脈取血5 mL，采用改良的Appel法[3]制備富血小板血漿，制備的PRP的終濃度為3%，備用。

1.3.2BMSCs培養：新生兔斷頸法處死，采用Kopen的方法[4]培養并純化出BMSCs細胞液，調節細胞濃度為1×106/mL。

1.3.3兔股骨頭壞死模型的建立[5]及給藥方法：向新西蘭大白兔靜脈注射10 μg/kg大腸桿菌內毒素兩次，注射間隔為24 h。第二次注射大腸桿菌內毒素后，臀肌注射甲基強的松龍20 mg/kg，注射3次，每次注射間隔為24 h。甲基強的松龍注射4 w后，分別對不同實驗組兔股骨頭內髓芯減壓后注射RPR(0.4 mL 3%)、BMSCs(1 mL 1×106/mL)、BMSCs (1 mL 1×106/mL)+ PRP(0.4 mL 3%)，每周注射1次，連續注射4周。空白組及模型組不注入任何物質。

1.3.4觀察指標：造模12 w后處死動物，切取股骨頭固定、包埋、切片、觀察病理學變化。對股骨頭進行HE染色觀察兔股骨頭骨髓腔內的病理學及骨陷窩空缺率變化情況。酶聯免疫(ELISA)法檢測血清中血管內皮生長因子(VEGF)的含量。蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測股骨頭中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2的蛋白水平的變化。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 病理學組織觀察

空白組軟骨細胞均勻，排列整齊；骨髓腔內骨小梁完整，成骨細胞多。模型組軟骨細胞排列紊亂，大小不一，破骨細胞較多，脂肪細胞數量顯著增加。與模型組相比，PRP、BMSCs治療組軟骨細胞排列較整齊，成骨細胞有所增加，脂肪細胞明顯減少。

2.2 PRP與BMSCs對骨陷窩空缺率的影響

與空白組相比，模型組骨陷窩空缺率顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，各治療組的骨陷窩空缺率明顯下降(P<0.05)。結果見圖2，表1。

圖2 PRP與BMSCs對骨陷窩空缺率的影響(×400)Fig.2 The effect of PRP and BMSCs on lacuna vacancy rate (×400)A：空白組 B：模型組 C：PRP組 D：BMSCs組 E：PRP+ BMSCs組A: normal group; B: model group; C: PRP group; D: BMSCs group; E: PRP + BMSCs group

組別骨陷窩空缺率(%)空白組5.74±1.05模型組21.31±1.94?PRP組16.08±1.87?▲BMSCs組14.25±1.19?▲PRP+ BMSCs組11.89±1.46?▲

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

Notice： compared with normal group,*P<0.05; compared with model group,▲P<0.05

2.3 PRP與BMSCs對兔血清中VEGF的影響

與模型組相比，各治療組血清中 VEGF的含量均有所上升，差異有顯著性意義(P<0.05)。結果見表2。

表2 PRP與BMSCs對兔血清中VEGF的影響Table 2 The effect of PRP and BMSCs on serum levels of VEGF in rabbits

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

Notice： compared with normal group,*P<0.05; compared with model group,▲P<0.05

2.4 PRP與BMSCs對股骨頭中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2表達的影響

與空白組相比，模型組股骨頭中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。與模型相比，各治療組股骨頭組織中的BMP-2、Smad1、Smad5、Run2蛋白水平明顯上升，其中PRP+BMSCs組水平上升地最高(P<0.05)。結果見表3，圖2。

組別BMP-2Smad1Smad5Runx2空白組0.55±0.120.42±0.150.31±0.100.46±0.15模型組0.39±0.11?0.21±0.08?0.17±0.07?0.28±0.06?PRP組0.67±0.08?▲0.56±0.14?▲0.42±0.19?▲0.57±0.17?▲BMSCs組0.74±0.14?▲0.62±0.15?▲0.53±0.08?▲0.65±0.22?▲PRP+ BMSCs組0.98±0.25?▲0.74±0.26?▲0.65±0.17?▲0.96±0.19?▲

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

Notice： compared with normal group,*P<0.05; compared with model group,▲P<0.05

圖3 PRP與BMSCs對股骨頭中BMP-2、Smad1、Smad5、Run2表達的影響Fig.3 The effect of PRP and BMSCs on the expressions of BMP-2, Smad1, Smad5, and Run2 in the femoral head

3 討論

股骨頭壞死在臨床上可分為創傷性和非創傷性兩大類別。外傷所致的股骨頭損傷、股骨頸骨折等引起股骨頭血運障礙的股骨頭壞死的發病機制目前研究已經基本明確[6]。激素、酒精、放射性損傷、一些全身性疾病等繁雜因素而造成的非創傷性股骨頭壞死的發病機制尚未完全明確[7,8]。因此針對性的治療比較困難，對股骨頭壞死最佳的治療方法仍在不斷的探索進行中。

骨形態發生蛋白(BMP)是一種廣泛存在于骨基質中的酸性糖蛋白，是轉化生長因子(TGF)-β超家族中最大的一族。可通過體內自分泌和旁分泌形式分泌出BMP，經信號轉導并經配體與細胞表面I型和II型BMP受體的結合，從而誘導骨、軟骨及骨相關結締組織的形成[9]。其中BMP-2是促進骨形成和誘導成骨細胞分化的細胞外信號分子。近年研究表明，非創傷性股骨頭壞死股骨頭局部BMP的表達過低，這可能是影響壞死骨修復與重建的重要原因。Smads蛋白在將TGF-β信號從細胞表面受體傳導至細胞核的過程中起到關鍵性作用，分為9個亞型。BMP可激活Smad1、Smad5、Smad8的Smads蛋白亞型，從而誘導調控間充質干細胞向成骨方向分化的特異性轉錄Runx2的基因表達[10]。

骨髓間充質干細胞(BMSCs)是一類中胚層來源的干細胞，為骨組織工程的首選種子細胞。在機體內骨的形成和損傷后的修復中發揮著重要的作用[11]。富血小板血漿(PRP)是通過離心的方法從自體血中提取出來的血小板濃縮物。含有多種生長因子(TGF-β、VEGF)與纖維蛋白原。實驗結果顯示，PRP與BMSCs能改善股骨頭壞死的恢復情況，上調BMP-2、Smad1、Smad5、Run2蛋白的表達。且PRP與BMSCs的治療效果最好。可見PRP與BMSCs同時應用時產生協同作用，PRP促進BMSCs的增殖與分化，提供股骨修復中所需的生長因子，通過上調BM P-2的蛋白水平，激活Smads信號通路，繼而誘導調控間充質干細胞向成骨方向分化的特異性轉錄Runx2的基因表達，促進成骨細胞分化及骨的形成，加速骨組織的修復與愈合。