復方貞術調脂膠囊對糖皮質激素誘導骨質疏松大鼠股骨和腰椎骨密度及生物力學特性的研究

孫平 胡伶平 董群偉 蔡妹群 王曉東 郭姣 劉忠厚

1. 廣東藥學院附屬第一醫院骨質疏松基地，廣東 廣州 510006 2. 廣東藥學院附屬第一醫院骨科, 廣東 廣州 510006 3. 國家中醫藥管理局高脂血癥調肝降脂重點研究室, 廣東藥學院國家中醫藥管理局脂代謝三級實驗室, 廣東 廣州 510006 4. 中國老年學學會骨質疏松委員會, 北京 100102

糖皮質激素因具有強大的抗炎、抗免疫和抗休克作用，被廣泛應用于器官移植、自身免疫疾病、炎癥及腫瘤治療等領域。但其導致的主要副作用之一——糖皮質激素性骨質疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP)，已成為普遍存在的臨床問題，GIOP是醫源性骨質疏松的最常見原因，其發生率僅次于絕經后骨質疏松癥及老年性骨質疏松癥而位居第3位[1]。有報道指出，糖皮質激素首先是引起脂質代謝紊亂，其次引起骨量減少，如近年來發現他汀類藥物在抗骨質疏松的治療中起到積極作用[2,3]，但對肝臟、腎臟等副作用較明顯。基于此，本研究選用我校自主創新研發的具有護肝調脂作用的復方貞術調脂膠囊(FTZ)，通過改善脂代謝紊亂，以期對GIOP的防治起到有益作用。

1 材料和方法

1.1 動物模型和實驗分組

3月齡SPF級雄性SD大鼠32只，體質量(210±15)g，購于南方醫科大學實驗動物中心。適應喂養7 d后，隨機平均分為4組：Nrm組為正常對照組，Met組為皮下注射甲強龍(Met)5 mg/(kg·d)，每周5次[4]，低劑量組(FTZL)和高劑量組(FTZH) 分別在Met組基礎上每天給予FTZ 1.5 g/kg和FTZ 6g/kg灌胃[5]，4組大鼠均單籠喂養，自由進食和飲用純凈水，實驗期12w。實驗期滿后用3.3%濃度的水合氯醛溶液(10mL/kg)麻醉，左心室放血處死大鼠。雙側股骨及第4，5腰椎(L4, L5)，剔除附著的軟組織，用浸濕生理鹽水的紗布包裹，置于置于-20 ℃的冰箱內保存備骨生物力學和骨密度測定(1w內測定)。

1.2 生物力學測定

1.2.1三點彎曲試驗：將剔除軟組織的右側股骨，置于生物力學試驗機(MTS-858型, 美國)上，支點跨距17 mm，加壓點為中點，加載速度2 mm/min，加載至骨折，計算機記錄載荷-位移曲線，根據載荷-位移曲線計算最大載荷、剛度和彈性模量。股骨中點所在截面近似地認為呈橢圓形，數字游標卡尺(精密度0.02 mm)測量其內、外徑，計算骨宏觀幾何參數。

1.2.2壓縮試驗：去除L4椎弓及附件單留椎體，砂紙打磨椎體上下表面，使之成為相互平行的平面，數字游標卡尺(精密度0.02mm)測量椎體高度，根據阿基米德定律計算椎體橫斷面的面積。將標本置于生物力學試驗機(同上)上，下表面緊貼于不銹鋼板上，加載的方向與不銹鋼的表面垂直，行壓縮試驗，加速度為2 mm/min，計算機記錄載荷-位移曲線。根據載荷-變形曲線計算椎體的最大載荷和剛度。

1.3 股骨和L5骨密度測定

將左側股骨及L5置于QDR4500A型雙能X線骨密度測定儀上，計算機采用小動物梯級標準分析軟件，自動記錄股骨和L5骨密度。掃描速度10 mm/s，掃描間距0.5 mm× 0.5 mm。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 FTZ對大鼠骨生物力學參數的作用

實驗期滿后，Met組大鼠L4和股骨的最大載荷、剛度、彈性模量顯著低于Nrm組相應指標(P<0.001,P<0.01)；FTZL組大鼠最大載荷、剛度、彈性模量較Met組有升高趨勢，但兩組間各指標均無顯著性差異(P>0.05)；FTZH組大鼠L4和股骨的最大載荷、剛度、彈性模量顯著高于Met組相應指標(P<0.01,P<0.05)，且L4的最大載荷FTZH組顯著高于FTZL組(P<0.05)，L4的剛度、彈性模量和股骨的最大載荷、剛度、彈性模量FTZH組較FTZL組有增加趨勢，但兩組間各指標均無顯著性差異(P>0.05) (見表1, 2)。

表1 各組大鼠股骨(右)三點彎曲試驗的結果Table 1 Tri-point bending parameters of the rat femur (right) in different

注：*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001, vs Nrm；#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001 vs Met；▲P< 0.05 vs FTZL

表2 各組大鼠L4壓縮試驗幾何及力學參數的結果Table 2 Compression and geometrical parameters of

注：*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001 vs Nrm；#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001 vs Met；▲P< 0.05 vs FTZL.

2.2 FTZ對大鼠股骨和腰椎中段截面幾何參數的變化

Met組大鼠椎體橫斷面面積、股骨中段截面面積和皮質骨厚度顯著低于Nrm組(P<0.001,P<0.01)，股骨骨髓腔面積顯著高于Nrm組(P<0.01)；FTZL組大鼠椎體橫斷面面積、股骨中段截面面積和皮質骨厚度高于Met組，股骨骨髓腔面積低于Met組，但各指標間均無顯著性差異(P>0.05)；FTZH組大鼠椎體橫斷面面積和皮質骨厚度顯著高于Met組(P<0.05)，股骨髓腔面積顯著低于Met組(P<0.05)，股骨中段截面面積較Met組有增加趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)， FTZH組椎體橫斷面面積、股骨中段截面面積和皮質骨厚度較FTZL組有增加趨勢，股骨骨髓腔面積低于FTZL組，但各指標間均無顯著性差異(P>0.05) (見表2, 3)。

表3 各組大鼠股骨中段截面幾何參數的結果Table 3 Geometrical parameters of the middle femur section

注：*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001, vs Nrm；#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001 vs Met；▲P< 0.05 vs FTZL

2.3 藥物對大鼠左側股骨和L5骨密度的作用

4組大鼠間左側股骨和L5的骨密度均有差異(P<0.001,P<0.01,P<0.05)，Met組顯著低于Nrm組(P<0.001)；FTZH組股骨和L5骨密度均高于Met組(P<0.01,P<0.05)；FTZL組L5骨密度顯著高于Met組(P<0.05)，FTZH組L5骨密度顯著高于FTZL組(P<0.05) (表4)。

表4 各組大鼠骨密度結果Table 4 Results of BMD in different groups

注：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001, vs Nrm；#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001 vs Met；▲P<0.05 vs FTZL

3 討論

上世紀五十年代開始將糖皮質激素作為抗炎和免疫抑制藥物廣泛應用于慢性阻塞性肺病、哮喘、風濕免疫性疾病、炎性腸病等多種疾患及器官移植后的治療中。長期使用糖皮質激素會導致脂質代謝紊亂、骨質疏松癥及骨折危險性增加等一系列副作用，成為其臨床應用的主要障礙。據統計，在接受糖皮質激素治療的慢性疾病人群中，最終有30%～50%發展為骨質疏松[6]，有超過1/3的絕經后婦女長期(> 6個月)口服糖皮質激素治療，椎體至少發生過1次椎體骨折[7]，且絕經后婦女長期使用糖皮質激素的患者往往同時伴有骨質疏松和脂質代謝紊亂[8,9]，有學者調查發現絕經后婦女的血漿LDL-C與股骨頸及全髖BMD呈顯著負相關[10]，TC和LDL與股骨頸和腰椎BMD呈顯著負相關[11]。高脂血癥與骨質疏松兩者在發病機制及臨床治療方面的關系已引起人們越來越多的關注。在調脂治療中，骨質疏松常常會改善，而在抗骨質疏松治療的過程中，脂代謝紊亂也往往會得以逆轉，因此高脂血癥與骨質疏松癥兩者在發病機制及臨床治療方面的相互關系已引起人們越來越多的關注。

對于GIOP的治療目前仍沒有理想方法，原因是由此引起的骨質疏松機制復雜。中藥尤其是中藥復方具有多環節，多靶點，多效應器官發揮功效的特點，其在防治脂質代謝紊亂及骨質疏松方面，有著較大的開發和應用價值。我校郭姣教授自主研發的FTZ主要以佛手、黃連、杜仲、白術、丹參等為主要成分，具有調脂、抑斑塊、保護內皮等一系列作用。研究發現，FTZ能有效調節實驗性動脈粥樣硬化家兔的脂代謝異常，對高脂血癥相關的HMG-CoA還原酶(HMGR)，肝臟X受體(LXR)，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)等均有潛在作用[5,12,13]。同時發現該藥物能夠顯著增加大鼠皮質骨厚度和骨小梁數目。因此本研究以調脂為基點，分別采用高、低劑量的FTZ以期觀察其對GIOP大鼠的骨量和骨質量的積極作用。

BMD是診斷骨質疏松癥的“金標準”，可以間接評價骨質健康情況及骨強度，能夠較好地預測骨折的發生風險。DXA在評價大鼠骨質疏松模型及療效的判定方面有很好的精確性和準確性，是一快速、可靠的技術手段。本研究發現，GIOP大鼠股骨和腰椎的BMD較正常組均顯著下降，與以往報道一致[4]，說明本實驗采用甲強龍致大鼠骨質疏松模型建立成功。同時FTZH組能夠顯著增加GIOP大鼠股骨和腰椎的BMD，FTZL組僅能夠顯著增加腰椎BMD，且FTZH組顯著高于FTZL組，提示FTZ能夠有效延緩糖皮質激素誘導的大鼠骨量丟失特別是松質骨，且呈劑量依賴性。骨生物力學是全面評價骨質量最可靠的指標，是骨量、骨結構和骨強度的綜合體現，在評價治療骨質疏松藥物對骨質量影響中的作用無法被其他測定方式所取代。其中三點彎曲實驗主要反映皮質骨的力學特性，壓縮實驗主要是松質骨力學特性的體現。我們發現，GIOP大鼠股骨和腰椎的結構力學特性(最大載荷)、材料力學特性(剛度和彈性模量)均較正常組顯著降低，與其BMD的下降相一致，通過給予FTZH可顯著增加大鼠股骨和腰椎的結構力學特性，在股骨三點彎曲實驗中，高、低劑量的FTZ兩組間未見顯著性差異；而在腰椎壓縮實驗中，FTZH組的最大載荷顯著優于FTZL組，表明高劑量的FTZ對提高骨生物力學特性方面有積極作用，且呈劑量依賴性，特別是對松質骨力學特性的改善作用與BMD結果相符。骨橫截面積是反映骨膜骨形成的一項可靠指標，本研究對股骨和腰椎宏觀幾何結構的測量數據表明，GIOP大鼠股骨和腰椎宏觀幾何結構的生物力學應答調節機能減弱或消失，導致股骨中段截面面積和椎體橫截面積顯著性降低，股骨骨髓腔面積顯著增加，骨皮質厚度減少，說明大鼠骨膜骨形成受抑制，進而影響到大鼠股骨及椎體的生物力學特性，與既往研究一致[14]。通過給予高劑量FTZ干預后可顯著增加大鼠股骨和腰椎的結構力學和材料力學特性，改善骨宏觀幾何參數，對GIOP大鼠骨膜骨形成起到積極作用，在提高骨生物力學特性，增加骨質量，降低骨折發生風險方面效果明顯。

本研究結果初步表明，具有護肝調脂作用的FTZ可以延緩GIOP大鼠的骨量丟失，增加BMD，維持骨生物力學特性，提示FTZ在改善骨質量、降低骨折的發生方面有一定的積極作用。本研究只是初步觀察FTZ對骨質疏松癥的防治作用同時給我們提供了新的思路和方法，從改善脂質代謝紊亂為出發點或許是抗骨質疏松癥治療的另一途徑，后續FTZ對骨代謝的影響及其機制方面的探討目前正在進行中。