青藤堿降低兔膝骨關節炎模型瘦素含量及其受體表達

鄭潔 王瑞輝 楊威 寇久社

1. 陜西中醫藥大學針灸推拿學院，陜西 咸陽 712046 2. 陜西中醫藥大學中醫系，陜西 咸陽 712046 3. 陜西中醫藥大學第二附屬醫院，陜西 咸陽 712046

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種累及關節軟骨、軟骨下骨、滑膜和韌帶等關節周圍多種組織的退行性關節疾病，其具體發病機制至今仍不明確。脂肪因子是一類由白色脂肪組織分泌的內源性活性多肽，被認為與肥胖、胰島素抵抗、糖尿病等多種代謝性疾病密切相關。近來發現，瘦素(leptin)、脂聯素(adiponectin)、內脂素(visfatin)和抵抗素(resistin)等多種脂肪因子在炎性反應、軟骨退變以及軟骨下骨重塑等多個OA病理過程中發揮了重要作用[1-2]。青藤堿是從傳統治療風濕性疾病中藥清風藤中提取的一種生物堿，具有鎮痛、抗炎、調節免疫、降血壓、抗心律失常等藥理作用[3]。筆者前期實驗研究發現，青藤堿關節腔注射可緩解兔膝關節骨性關節炎(knee osteoarthritis，KOA)滑膜炎性反應、降低關節液脂聯素、內脂素和抵抗素水平，對軟骨具有保護作用。本實驗通過觀察青藤堿關節腔注射對木瓜蛋白酶誘導的兔KOA模型血清及關節液瘦素水平以及軟骨瘦素受體(Ob-Rb)mRNA和蛋白表達的影響，探討青藤堿治療KOA的部分作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物：新西蘭大白兔40只，雌雄各半，體質量1.8～2.2 kg，由西安交大醫學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(陜)2008-008。單籠、標準飼料喂養，室溫20℃～25℃，相對濕度45%～60%，每天正常光照，空氣流通，自由攝食、飲水。

1.1.2藥物及試劑：正清風痛寧注射液(湖南正清制藥集團股份有限公司，批號1304402-003，規格2 ml：50 mg)，玻璃酸鈉注射液(山東博士倫福瑞達制藥有限公司，批號130308011，規格2 ml：20 mg)，木瓜蛋白酶(Merck公司，貨號107147，活力6000 USP-U/mg)。瘦素ELISA試劑盒(北京諾博萊科技有限公司)，Ob-Rb多克隆抗體(英國Abcam公司)，RNA提取試劑盒(北京全式金公司)，qPCR反應試劑盒(北京全式金公司)，Ob-Rb引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.1.3儀器：Bio-Tec ELX808型酶標儀(美國Bio-Tec公司)，超薄切片機(德國LEICA公司)，5430R冷凍高速離心機(德國Eppendorf公司)，AB7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Thermo NanoDrop 2000C紫外分光光度計(美國Thermo公司)，濕式轉移電泳槽(美國BioRad公司)，凝膠成像儀(美國BioRad公司)，硝酸纖維素膜(Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1模型制備：采用木瓜蛋白酶關節腔注射法，分別于實驗的第1、4、7天對造模組兔進行關節腔注射。(1)木瓜蛋白酶溶液配制：將木瓜蛋白酶按4%(20 mg/0.5 mL)的濃度溶解于生理鹽水中，裝入50 mL無菌瓶中并置于 0～4℃冰箱內保存備用。(2)兔關節腔注射方法：兔右膝關節備皮、75%乙醇消毒后，用左手從下方和兩旁將右側膝關節輕度屈曲位固定，右手持1 mL注射器在髕韌帶附著點外上方約 0.5 cm 處向髁間窩方向進針，當出現落空感時表明已進入關節腔內，注入4%木瓜蛋白酶水溶液0.5 mL。

1.2.2分組及干預措施：40只兔先分為空白組(8只)和造模組(32只)，采用木瓜蛋白酶注射法于實驗的第1、4、7天對造模組兔右膝關節腔注射0.5 mL的4%(20 mg)木瓜蛋白酶溶液。首次注射4周后隨機處死2只造模兔，病理學觀察出現典型軟骨退變表現，同時兔右膝關節出現腫脹、跛行，表明造模成功。造模成功后，將造模組隨機分為模型組(Model)、透明質酸鈉組(HA)和青藤堿組(SIN)，每組10只。根據成人用藥劑量(透明質酸鈉和青藤堿均為2 ml/次)按Meeh-Rubner公式計算人兔等效劑量，具體注射劑量為0.2 mL/次。除空白組外，對各組動物造模側膝關節行關節腔注射，青藤堿組膝關節腔注射鹽酸青藤堿注射液0.2 mL(5 mg)，每3 天一次，10次一療程，共給藥10次；透明質酸鈉組膝關節腔注射透明質酸鈉注射液0.2 mL，每6天一次，5次一療程，共5次；模型組膝關節腔注射生理鹽水0.2 mL，注射次數同青藤堿組。干預時間共計30天。實驗過程中對動物的處理方法符合中華人民共和國科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2.3標本采集：(1)血清采集：干預結束后第2天，耳中動脈取血5 mL，4000 r/min離心10 min，分離血清后-80℃冰箱保存備檢。(2)關節液采集：干預結束后第2天，生理鹽水沖洗法收集關節液。于兔的右膝關節腔內注入生理鹽水注射液1 mL(注射方法同前)，充分活動膝關節使生理鹽水與關節液充分混合，再抽取關節腔生理鹽水沖洗液0.6 mL～1 mL至EP管，4000 r/min離心10 min，取上清，-80℃保存備檢。(3)軟骨采集：用刀片仔細刮除取下股骨內、外側髁表面的關節軟骨，內側髁軟骨置入裝有RNA保存液的EP管中后保存于-80℃冰箱，留待qPCR檢測，外側髁軟骨置于EP管中后保存于-80℃冰箱，留待Western blot檢測。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1血清及關節液瘦素含量檢測(ELISA法)：采用ELISA法測定血清和關節液中瘦素含量，操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.2Ob-Rb mRNA表達檢測(qPCR法)：取股骨內側髁軟骨100 mg，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，并用紫外分光光度計測定其純度和濃度。用RNA逆轉錄試劑盒進行反轉錄，合成第一鏈cDNA。qPCR反應條件：50℃ 2 min和95℃ 10 min預變性；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(收集熒光信號)。所有PCR均做3個復孔，重復3次，結果以2-ΔΔCT表示。qPCR引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequence of qPCR

1.3.3Ob-Rb蛋白表達檢測(Western blot法)：取股骨外側髁軟骨100 mg，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定其濃度和純度，取適量樣品進行SDA-PAGE。蛋白在SDA-PAGE電泳下分離，電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗稀釋液中4℃過夜，洗膜3次，二抗稀釋液中室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL試劑反應1 min，X線曝光。以β-actin作為內參對照，Image J軟件對條帶進行灰度掃描，以目的條帶與β-actin的平均吸光度比值表示蛋白水平，進行半定量分析。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 各組兔血清及關節液瘦素含量比較

實驗過程中，模型組、透明質酸鈉組和青藤堿組兔各死亡1只，各組實驗兔最終為空白組8只，其余3組各9只。ELISA檢測結果顯示：模型組和透明質酸鈉組血清瘦素含量較空白組明顯升高，差異有統計學意義(分別為P<0.01，P<0.05)，青藤堿組血清瘦素含量顯著低于模型組和透明質酸鈉組，差異有統計學意義(分別為P<0.01，P<0.05)；模型組、透明質酸鈉組和青藤堿組關節液瘦素含量較空白組均明顯升高，差異有統計學意義(分別為P<0.01，P<0.01，P<0.05)，但青藤堿明顯低于模型組和透明質酸鈉組，差異有統計學意義(分別為P<0.01，P<0.05)，見表2。

表2各組兔血清及關節液瘦素濃度比較(μg/L)
Table2Comparison of levels of leptin in serum and synovium between each group(μg/L)

組別n血清關節液空白組80.599±0.0230.677±0.100模型組90.759±0.030??1.030±0.124??透明質酸鈉組90.709±0.054?0.935±0.055??青藤堿組90.620±0.129##Δ0.789±0.044? ##Δ

注：與空白組比較，*為P<0.05，**為P<0.01；與模型組比較，#為P<0.05，##為P<0.01；與透明質酸鈉比較，Δ為P<0.05

Note： Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01; Compared with model group,#P<0.05,##P<0.01; Compared with HA group,ΔP<0.05.

2.2 各組軟骨Ob-Rb mRNA表達比較

與空白組比較，模型組和透明質酸鈉組Ob-Rb mRNA均呈高表達，差異有統計學意義(P<0.05)；青藤堿組Ob-Rb mRNA表達水平低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；青藤堿組與空白組比較無明顯差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組軟骨Ob-Rb mRNA表達水平Fig.1 Expression of Ob-Rb mRNA in cartilage in each group注：與空白組比較，*為P<0.05；與模型組比較，#為P<0.05；與透明質酸鈉比較，Δ為P<0.05Note: Compared with control group, *P<0.05; Compared with model group, #P<0.05; Compared with HA group, ΔP<0.05.

2.3 各組軟骨Ob-Rb蛋白表達比較

模型組Ob-Rb較空白組明顯呈高表達，差異有統計學意義(P<0.01)；青藤堿組和透明質酸鈉組顯著低于模型組，有極顯著差異(P<0.01)；青藤堿與空白組及透明質酸鈉組比較無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組軟骨Ob-Rb蛋白表達水平Fig.2 Expression of Ob-Rb protein in cartilage in each group注：與空白組比較，**為P<0.01；與模型組比較，##為P<0.01 Note: Compared with control group, **P<0.01; Compared with model group, ##P<0.01.

3 討論

瘦素是由肥胖基因編碼的肽類激素，主要由白色脂肪組織分泌。正常軟骨通常不表達瘦素，而瘦素及Ob-Rb在進行性OA患者軟骨及滑液中的表達顯著提高[4]。研究發現，關節液中瘦素濃度與影像學顯示的OA患者關節破壞程度緊密相關[5]。Simopoulou等[4]觀察了Ob-Rb在體外培養的正常軟骨細胞、OA患者損傷區軟骨細胞及OA患者損傷鄰近區軟骨細胞的mRNA及蛋白表達，結果發現OA軟骨Ob-Rb表達水平顯著高于正常軟骨，嚴重損傷區軟骨Ob-Rb表達水平明顯高于輕度損傷區。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一組能夠降解細胞外基質的內肽酶，在OA軟骨基質降解期發揮重要作用[6]，瘦素可誘導OA關節軟骨表達MMP-9和MMP-13[7]。研究發現，瘦素誘導下的人軟骨細胞IL-8的表達量顯著提高[8]，瘦素還可獨立或與IL-1β協同作用，通過NF-κB、蛋白激酶C和MAP激酶信號通路，上調MMP-1和MMP-3在OA患者軟骨的表達，這一機制與OA患者滑液中高濃度的MMP-1和MMP-3直接相關[9]。

清風藤為防己科藤本植物青藤的藤莖，性味辛、苦、溫，入肝、脾經，具有祛風濕、通經絡等功效。青藤堿是清風藤的主要活性成分。臨床研究表明，青藤堿可緩解OA患者膝關節疼痛、腫脹及晨僵等癥狀，顯著改善膝關節功能障礙[10-11]。青藤堿膝關節腔注射可降低關節液中TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2含量，延緩軟骨退變進程，提示青藤堿對OA軟骨具有保護作用，其機制可能與其抗炎作用有關[12-14]。

本實驗ELISA結果表明，青藤堿關節腔注射可顯著降低KOA兔血清及關節液瘦素水平。軟骨Ob-Rb基因和蛋白表達檢測結果顯示，KOA兔軟骨中Ob-Rb呈高表達，與文獻報道一致，青藤堿關節腔注射可明顯下調Ob-Rb在軟骨的表達。以上結果提示，降低血清及關節液瘦素含量以及下調Ob-Rb在軟骨的表達可能是青藤堿關節腔注射治療OA的機制之一。