pcDNA3-hNGF真核表達載體的構建及其在大鼠骨髓基質干細胞中的表達

粟 謀 貝朝涌* 蔣林彬 徐威, 陳寧

1.桂林醫學院附屬醫院四肢創傷骨科 541001 2.桂林醫學院生物技術學院 541004

神經生長因子(Nerve Growth Factor, NGF)在促進骨折愈合修復中是重要生長因子之一[1]。骨髓基質干細胞(Bone Marrow Stromal Cells, BMSCs)是目前已成為應用較廣泛的骨組織工程重要種子細胞[2，3]。基因組織工程給我們提供了良好的方法，它利用基因轉染技術使得編碼特定功能因子的基因轉至種子細胞里或生物活性基質材料，讓轉染細胞表達目的基因及產物，在體內促進細胞的增殖、分化而發揮正常的生理功能。

本研究實驗利用PCR方法擴增hNGF基因cDNA，構建重組質粒pcDNA3-hNGF并轉染至大鼠BMSCs中，檢測其表達活性。為骨折的基因治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1試劑及材料 hNGF基因片段、TIANGEN逆轉錄試劑盒、無內毒素質粒大提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、限制性內切酶HindⅢ、BamHI、pcDNA3質粒載體、T4-DNA連接酶(NEB)、DH5α大腸桿菌(武漢淅瑪生物技術有限公司)，DMEM(Low Glu)細胞培養基、胎牛血清(Hyclone)、DNA marker(南寧天地揚生物有限公司)，Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑(invitrogen公司)，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，ab52918NGF抗體(ABCAM公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。大鼠第5代BMSCs細胞由本課題組分離培養。

1.2方法

1.2.1真核表達載體pcDNA3-hNGF的構建及鑒定：① 引物的設計 根據GenBank公布的hNGF-cDNA。用Primer Premier 5.0軟件設計引物。交由武漢淅瑪生物技術有限公司合成。

上游引物: 5′-CCCAAGCTTGCCGCCACCA TGTCCATGTTGTTCTACACTCTGA -3′(含限制酶切位點HindⅢCCCAAGCTT)，

下游引物: 5′- CGCGGATCCTCAGGCTCTTCTC ACAGCCTTCCTGCTGA -3′(含限制酶切位點BamHI CGCGGATCC)。②目的基因的擴增 將hNGF基因片段按如下PCR程序擴增：預變性：94 ℃，3 min；變性：94 ℃，30 sec；退火：56 ℃，30 sec；延伸：72℃，1 min；共35個循環。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，用DNA純化試劑盒純化提取hNGF目的基因的PCR產物。③真核表達質粒pcDNA3-hNGF的構建及鑒定 目的DNA片段和pcDNA3分別進行HindⅢ和BamHI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測并線性化載體，用DNA純化試劑盒回收酶切DNA片段。酶切后的pcDNA3 線性質粒和目的DNA 片段與T4DNA 連接酶建立連接反應，16℃連接20 h至T載體上。取連接反應的產物轉化大腸桿菌DH5α，接種在含有氨芐青霉素的培養皿上，倒置培養12～16 h。根據藍白斑進行篩選，取陽性克隆進行細菌培養，提取質粒HindⅢ和BamHI雙酶切鑒定，并送測序鑒定。

1.2.2重組質粒pcDNA3-hNGF轉染大鼠BMSCs及Western blot檢測：復蘇凍存于液氮中的第5代大鼠BMSCs，培養于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養基中，將細胞轉入6孔板中，分為3組：A組為脂質體轉染組, B組為脂質體包裹的空質粒轉染組，C組為脂質體包裹hNGF的重組質粒轉染組。取純化的pcDNA3-hNGF及空載體pcDNA3各4 μg，按Lipofectamine2000說明書進行操作，將各組載體轉染大鼠BMSCs。收集轉染后72 h各組細胞，RIPA細胞裂解液裂解后，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉移到PVDF膜上。加入ab52918NGF抗體，使用辣根過氧化物酶標記的二抗孵化，通過超敏ECL法檢測試劑盒檢測目的蛋白條帶。

2 結果

2.1擴增的hNGF基因

PCR擴增hNGF基因，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見擴增得到約720 bp的片段。DNA序列測定表明擴增片段的核苷酸序列與GenBank上的hNGF編碼區基因完全一致(圖1)。

圖1 hNGF cDNA擴增后瓊脂糖電泳結果DL1000 Marker(Left to right)：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bpFig.1 Results of hNGF cDNA amplification agarose gel electrophoresis

2.2基因重組質粒pcDNA3-NGF的鑒定

2.2.1雙酶切驗證

使用HindⅢ、BamHI對2份重組質粒pcDNA3-hNGF進行雙酶切電泳鑒定。產生和hNGF cDNA大小一致的片段(圖2)。

圖2 pcDNA3-NGF雙酶切電泳結果DL2000 Marker(從左往右)：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp1，2泳道：雙酶切后pcDNA3-hNGF 3泳道：DL2000 MarkerFig.2 Results of pcDNA3-NGF double digestion electrophoresis.DL2000 Marker(Left to right)：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bpLanes 1,2: pcDNA3-hNGF after double digested.Lane 3: DL2000 Marker

2.2.2測序鑒定結果:將NGF基因經HindⅢ、BamHI雙酶切反應載體和pcDNA3 連接后，成功構建pcDNA3-hNGF，重組質粒送武漢淅瑪生物技術有限公司進行基因測序與對比分析，測序結果顯示重組質粒pcDNA3-hNGF插入的序列與GenBank 中hNGF上的序列完全一致。

2.3Western blot檢測pcDNA3-hNGF在BMSCs中的表達

收集轉染后72 h各組細胞行Western blot 檢測hNGF表達情況。Western blot 檢測到hNGF質粒轉染組有明顯的陽性條帶，而空質粒轉染組及脂質體轉染組的條帶較弱(圖3)。

圖3 Western blot 檢測hNGF蛋白表達Fig.3 Western blotting protein detection of hNGF expressionA: liposomal transfection group; B: empty plasmid transfection group; C: hNGF plasmid group

3 討論

有研究表明NGF對骨折愈合修復有明顯影響[4,5]。NGF對骨組織的愈合作用在各方面、各層次相互交叉。它促進骨折處的血液供應, 對骨折過程中的各種炎性細胞的調節；促進肽能神經纖維長入骨組織；增加骨折處的鈣沉積，促進成骨細胞的成骨增加成骨細胞活性；直接或間接地促進骨母細胞分化為軟骨細胞或骨細胞, 刺激骨細胞增殖分化，從而加速骨折愈合[6-8]。本實驗通過構建pcDNA3-hNGF表達質粒，利用基因轉染技術，使hNGF基因轉染至BMSCs，并在BMSCs表達hNGF目的基因蛋白。通過該生長因子在骨折局部的持續穩定表達，在體內促進軟骨細胞或骨細胞增殖、分化，從而達到促進骨折愈合的作用。

基因治療的關鍵環節之一是如何有效地將目的基因導入靶細胞內并使其穩定表達。目前研究有病毒法和非病毒法[9,10]。兩者各有利弊。脂質體介導基因轉染是常用的非病毒轉染法之一，其不存在病毒的污染，相對安全。但是，脂質體具有一定的細胞毒性，尤其是高濃度的脂質體可以使細胞裂解；并且不同的細胞系對不同的脂質體介導的基因轉染的反應有差異，因此研究者必須在每個細胞系中采用最優化的轉染比例[11,12]。脂質體介導基因轉染的效率與細胞接種密度、生長狀態、DNA和脂質體劑量、轉染時間等多種因素有關，其中DNA與脂質體的比例最為重要。在實驗中，我們發現當DNA的劑量1 μg時，脂質體劑量超過1 μL以后，脂質體的細胞毒性就非常明顯，轉染后的BMSCs的生長和分化受到極大影響。因此，本實驗根據Lipoefctmaine試劑盒推薦的最佳細胞密度(2×105/2ml/孔)、生長狀態(70%-80%融合)，通過確定的DNA和脂質體劑量(1 μg∶3 μL)，達到了較高的轉染效率和促BMSCs增殖和定向分化作用。

綜上所述，本實驗利用PCR方法擴增hNGF基因片段， 將hNGF基因片斷與T載體連接，構建T-hNGF質粒載體后轉化到大腸桿菌DH5α篩選陽性克隆, 分別用HindⅢ和BamHI雙酶切T-hNGF質粒和pcDNA3真核表達載體, 將克隆載體中hNGF基因重組到pcDNA3真核表達載體作酶切電泳、DNA 測序鑒定，測序結果顯示重組質粒pcDNA3-hNGF插入的序列與GenBank 中hNGF上的序列完全一致。pcDNA3-hNGF轉染至大鼠BMSCs后，經Western blot 檢測，證明重組質粒pcDNA3-hNGF轉染BMSCs后能在大鼠BMSCs過表達hNGF蛋白。

因此，本研究成功構建了pcDNA3-hNGF真核表達質粒，從而為應用神經生長因子修飾的骨髓基質干細胞進行骨折治療研究奠定實驗基礎。