靶向抑制PI3K對(duì)人體外周血破骨細(xì)胞分化p38/c-Fos信號(hào)通路調(diào)控的研究

王想福 孫鳳歧* 石瑞芳 王興盛 葉丙霖 范有福 楊峰

1.甘肅省中醫(yī)院，蘭州 730050 2.甘肅省中醫(yī)藥研究院，蘭州 730050

骨質(zhì)疏松作為一種常見的代謝性骨骼疾病，常見的疾病好發(fā)因素包括老化、炎癥性腸條件、甲亢以及藥物引起等[1]。國(guó)內(nèi)學(xué)者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)50歲以上骨質(zhì)疏松約有6944萬人，40歲以上漢族人群骨質(zhì)疏松癥患病率為12.4%，并且女性明顯多于男性[2-3]。國(guó)外部分學(xué)者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，美國(guó)每年有2500萬骨質(zhì)疏松癥患者，其中因骨質(zhì)疏松導(dǎo)致骨折約為150萬人,約為6%[1]，而我國(guó)每年因骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致骨折的人數(shù)卻高于10%。根據(jù)2014年我國(guó)骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)專家共識(shí)，目前國(guó)內(nèi)骨質(zhì)疏松患者人數(shù)仍有逐年增多趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類的健康。因此，骨質(zhì)疏松的治療已成為亟待解決的社會(huì)問題。鑒于目前西藥治療的費(fèi)用高、療程長(zhǎng)、不良反應(yīng)較多等弊端，大力發(fā)展其他療法治療該病顯得尤為重要。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號(hào)通路廣泛參與真核生物的細(xì)胞增殖、凋亡、分化調(diào)節(jié)等過程，并且該通路可促進(jìn)前體成骨細(xì)胞系的增殖、分化等過程，并可誘導(dǎo)部分破骨細(xì)胞的分化[4-5]，但是目前缺乏足夠的證據(jù)證明該信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞的早期生成有直接關(guān)系。因而增加對(duì)靶向抑制PI3K的認(rèn)識(shí)可對(duì)骨質(zhì)疏松的治療起到重要作用。本研究觀察了靶向抑制PI3K對(duì)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞的影響，從而更加了解靶向抑制PI3K對(duì)骨質(zhì)疏松治療的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

培養(yǎng)基 MEM，臨用時(shí)加10%小牛血清(NBS，Gibco BR)；消化酶(0.25 %胰蛋白酶，0.1 %Ⅱ型膠原酶，美國(guó)Sigma公司)；LY294002(美國(guó)Sigma公司)；D-Hanks液(美國(guó)Hyclone公司)；人重組RANKL蛋白和M-CSF蛋白；2.5%戊二醛固定液；青鏈霉素雙抗、淋巴細(xì)胞分離液等。

1.2 主要儀器及器械

二氧化碳培養(yǎng)箱，德國(guó)；純水系統(tǒng)，美國(guó)；電子天平，上海；超潔凈工作臺(tái)，蘇州；倒置相差顯微鏡 Olympus EX70，日本；光學(xué)顯微攝影系統(tǒng) Nikon E600型，日本；磁力攪拌器，上海；微量移液器，上海；RT-PCR 儀：LineGene 9600，杭州；低溫臺(tái)式高速離心機(jī)，上海；引物合成，上海生工。

1.3 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

健康志愿者外周血核細(xì)胞(所有志愿者均簽署倫理知情同意書)

1.4 細(xì)胞的培養(yǎng)

1.4.1體外破骨細(xì)胞誘導(dǎo)模型的復(fù)制：抽取健康志愿者外周血液共計(jì)13 ml，其中3 ml用于血常規(guī)檢查，將另外10 ml外周血加入50 ml離心管，并加入等體積的D-hanks液，混合均勻。取4 ml淋巴細(xì)胞分離液(室溫)加入15 ml無菌離心管，加入上述混合均勻的血液8ml置于淋巴細(xì)胞分離頁(yè)面上，離心并吸取含有單個(gè)核細(xì)胞的白膜層，再加入5倍體積D-hanks液，洗滌并充分離心，細(xì)胞沉淀中加入1ml含10%FBS的培養(yǎng)基，吹打均勻并計(jì)數(shù)細(xì)胞，預(yù)留活細(xì)胞率>95%，細(xì)胞數(shù)>107個(gè)的細(xì)胞懸浮液進(jìn)入下一步純化。利用RANKL、M-CSF誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。接種單個(gè)核細(xì)胞并置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。將沖洗并收集的離心并用MEM洗滌2次，并將細(xì)胞沉淀中加入1 ml含10% FBS及100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基，吹打并計(jì)數(shù)，預(yù)留活細(xì)胞率>95%，細(xì)胞數(shù)>107個(gè)的細(xì)胞懸浮液進(jìn)入下一步培養(yǎng)。將上述細(xì)胞調(diào)整為107/ml細(xì)胞懸液，分成加入RANKL和M-CSF的兩個(gè)體系，及時(shí)換液，鋪有細(xì)胞的骨片轉(zhuǎn)移至新孔培養(yǎng)，進(jìn)行TRAP染色。雙蒸水輕柔漂洗2次，加入100 μL蘇木素復(fù)染2 min，再次用雙蒸水沖洗細(xì)胞核為藍(lán)色，干燥后，采用熒光倒置顯微鏡觀察，攝像。取出骨片PBS沖洗，2.5%戊二醛固定10 min，再次PBS沖洗，去離子水超聲沖洗3 min×3次，酒精脫干并甲苯胺藍(lán)染色20 s，PBS沖洗，干燥再進(jìn)行骨吸收陷窩染色觀察。

1.4.2PI3K調(diào)控：根據(jù)上述方法獲得破骨細(xì)胞，并分為對(duì)照組(10%FBS+MEM+100U青霉素+100 μg/ml鏈霉素+30 ng/ml RANKL、25 ng/ml M-CSF)和干預(yù)(10%FBS+MEM+100U青霉素+100 μg/ml鏈霉素+30 ng/ml RANKL、25 ng/ml M-CSF+5 mg/ml LY294002)，將最終培養(yǎng)得到的細(xì)胞進(jìn)行鏡下觀察破骨細(xì)胞活性。提取RNA(均為冰上操作)，分別進(jìn)行勻漿、分相、沉淀、清洗、溶解、RNA定量及純度檢測(cè)、逆轉(zhuǎn)錄。PCR所需引物均有上海生工合成，以人β-actin作為內(nèi)參照，進(jìn)行凝膠電影檢測(cè)模板，進(jìn)行RT-PCR，每個(gè)反應(yīng)孔15μL體系，每個(gè)基因3個(gè)復(fù)孔，每組均設(shè)陰性對(duì)照。并進(jìn)行Western-Blot檢測(cè)，具體步驟如下：收集DATS處理后的OCs細(xì)胞，冷PBS洗2次后，加入適量的細(xì)胞裂解緩沖液，于4℃裂解1 h，10 000 rpm×10 min，吸取上清液，即為細(xì)胞總蛋白， BCA法進(jìn)行蛋白定量。調(diào)節(jié)每份樣品濃度，以等量的蛋白量加樣，樣品加入1∶ 4的5×SDS加樣緩沖液，沸水煮沸5 min，經(jīng)10%SDS-PAGE膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，膜用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(封閉液1 ∶200～1 000稀釋)，室溫孵育2小時(shí)；TBST洗3次，每次10 min；加相應(yīng)的辣根過氧化物酶連接的抗兔的二抗(封閉液1 ∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h；TBST洗3次，每次15 min；用ECL發(fā)光法檢測(cè)不同蛋白表達(dá)狀況；薄層掃描儀測(cè)定印跡區(qū)帶的光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17 .0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組樣本均數(shù)行t檢驗(yàn)，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LY294002對(duì)干預(yù)組和對(duì)照組破骨細(xì)胞的活性影響

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察可見誘導(dǎo)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞形態(tài)明顯，干預(yù)組破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的形成減少，活性減弱，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(圖1)。

圖1 LY294002對(duì)體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞活性影響(×10)Fig.1 Effect of LY294002 on the activity of osteoclasts in vitro (×10)

2.2 RT-PCR檢測(cè)c-Fos基因表達(dá)量結(jié)果

采用RT-PCR技術(shù)，對(duì)干預(yù)組破骨細(xì)胞中c-fos mRNA水平進(jìn)行了檢測(cè)。由圖可見，檢測(cè)物質(zhì)的溶解曲線較好，無非特異性雜帶。與對(duì)照組比較，LY294002作用的干預(yù)組c-fos的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低，有顯著性差異(P<0.01)。(如圖2)

圖2 c-fos 的mRNA表達(dá)結(jié)果Fig.2 Results of c-fos mRNA expression.注：與干預(yù)組比較，**P<0.01

2.3 采用Western-Blot檢測(cè)P38蛋白表達(dá)水平

Western -Blot檢測(cè)結(jié)果顯示干預(yù)組p-P38蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。(如圖3、4)

圖3 p-p38/p38蛋白檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of p-p38/p38 protein test

圖4 p-p38/p38蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.4 Results of p-p38/p38 protein expression.注：與干預(yù)組比較，**P<0.05；

3 討論

PI3K信號(hào)通路作為細(xì)胞中常見的一種，因?yàn)樵撔盘?hào)通路在腫瘤腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制中占據(jù)重要位置[6]。最新研究認(rèn)為，IGF-1等生長(zhǎng)因子可激活PI3K信號(hào)通路，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化并有效抑制其凋亡的重要作用，部分學(xué)者通過大量細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，體外破骨細(xì)胞上清液也可通過PI3K信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖和分化，但有些研究認(rèn)為該信號(hào)可能產(chǎn)生抑制成骨細(xì)胞分化的作用[7-11]，目前關(guān)于PI3K信號(hào)通路對(duì)體外多能干細(xì)胞的分化和調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明[12]。本研究選取健康成人外周血做為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探索PI3K信號(hào)通路對(duì)體外破骨細(xì)胞的增殖和分化的影響。增殖和分化的進(jìn)程十分復(fù)雜，并非連續(xù)不斷的過程，尚未發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)干細(xì)胞增殖和促進(jìn)定向分化同時(shí)進(jìn)行[13]。本研究通過加入PI3K特異性阻斷劑LY294002，觀察抑制PI3K信號(hào)對(duì)體外破骨細(xì)胞增殖和分化的影響，通過研究發(fā)現(xiàn)，加入PI3K特異性阻斷劑LY294002的干預(yù)組相對(duì)于對(duì)照組破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的形成減少，活性減弱，說明LY294002可能具有抑制體外破骨細(xì)胞增殖和分化的作用。

綜上所述， PI3K信號(hào)通路參與體外破骨細(xì)胞增殖和成骨分化調(diào)控的過程。部分學(xué)者認(rèn)為該信號(hào)通路可能夠通過多種途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞生成，并能夠有效抑制破骨細(xì)胞分化，進(jìn)而能夠在機(jī)體雌激素缺乏時(shí)盡量減少骨質(zhì)的丟失，以至提高骨密度和骨礦含量，但是具體作用機(jī)制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K信號(hào)可能參與骨質(zhì)疏松疾病發(fā)生、發(fā)展的過程，并與其他信號(hào)通路之間存在共同作用從而引起骨質(zhì)疏松的作用，目前臨床試驗(yàn)應(yīng)用PI3K特異性阻斷劑LY294002治療腫瘤疾病的部分文章已經(jīng)發(fā)表，但是尚缺乏足夠有效的理論研究表明PI3K特異性阻斷劑LY294002對(duì)于人體骨質(zhì)疏松的具體治療作用機(jī)制和臨床治療效果。進(jìn)一步研究PI3K特異性阻斷劑LY294002對(duì)于體外、體內(nèi)破骨和成骨細(xì)胞等細(xì)胞行為的具體作用機(jī)制[12]，將為基因靶向治 療和干細(xì)胞治療提供重要的理論依據(jù)和確切的臨床療效。