紅車軸草總異黃酮含藥血清對MC3T3-E1細胞增殖、分化和礦化的影響

余 倩 宋雙紅,2 李翠芹*

1.西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室/藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室/陜西師范大學生命科學學院，陜西 西安 710119 2.西北工業大學生命學院特殊環境生物物理學研究所，空間生物實驗模擬技術重點實驗室，陜西 西安710072

紅車軸草(TrifoliumpratenseL.)是一種多年生草本植物，屬于豆科車軸草屬，又名紅三葉草，其花序和花枝含有大量異黃酮成分，因其具有雌激素樣作用而備受關注[1]。研究表明紅車軸草總異黃酮具有改善婦女更年期癥狀和防治療骨質疏松的作用[1-3]。本研究采用血清藥理學和體外培養MC3T3-E1成骨樣細胞的方法觀察含紅車軸草總異黃酮的大鼠血清對MC3T3-E1成骨樣細胞增殖、分化及礦化的影響，從細胞學水平探討紅車軸草總異黃酮促進骨形成的作用機制，為紅車軸草總異黃酮治療骨質疏松癥的研究提供一定的資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物與細胞系：健康SD雌性大鼠32只，體重200±20 g，購自第四軍醫大學SPF動物實驗中心，動物合格證號陜醫動字08-014號。飼養條件：室溫24±2 ℃，相對濕度40%～70%，每日人工照明和黑暗處理各12 h，自由飲水，喂食顆粒飼料。MC3T3-E1成骨樣細胞系(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)。

1.1.2藥物和試劑：紅車軸草總異黃酮(陜西慈緣生物技術有限公司，含量≥98.0%，批號為CY140415)；α-MEM培養基和胎牛血清(FBS)(Gibco公司)；維生素C、β-甘油磷酸鈉、噻唑蘭(MTT)和胰蛋白酶(Sigma公司)；堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)；骨鈣素(OC)測試盒(北京科盈美科技有限公司)；茜素紅(天津化學試劑廠)；鏈霉素、青霉素(華北制藥廠)；二甲亞砜(DMSO)(MP Biomedicals公司)，其余試劑均為分析純級。

1.1.3儀器：恒溫CO2培養箱(新加坡藝思高科技有限公司)，Infinite M200型多功能酶標儀(奧地利Tecan公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，YJ-875型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)，離心機(江蘇牡丹離心機制造有限公司)，超低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1含藥血清的制備：32只雌性SD大鼠，隨機分成2組，一組為服藥組，按100 mg/kg灌服紅車軸草總異黃酮，每天1次，連續7 d。另一組為對照組，只灌服相同體積的生理鹽水。第7 d灌胃1.5 h后，所有大鼠均在乙醚麻醉下自腹主動脈抽取血液，同組合并后于4℃靜置30 min，以2000×g、4℃離心20 min獲取紅車軸草總異黃酮含藥血清或對照血清(生理鹽水含藥血清)。血清在56℃滅活30 min， 0.22 μm 濾膜過濾除菌后，-80℃保存備用，使用時注意避免反復凍融。

1.2.2細胞培養：MC3T3-E1細胞復蘇后接種于細胞培養瓶中，以含10% FBS、1%配制好的雙抗的α-MEM培養基培養，2 d換液1次，待細胞鋪滿80%瓶底后胰蛋白酶消化傳代，繼續培養，待細胞再次鋪滿80%瓶底后胰蛋白酶消化，以不同的密度接種于96孔板或者24孔板進行實驗。

1.2.3細胞增殖測定：培養中的細胞鋪滿80%～90%瓶底后胰蛋白酶消化傳代，以2×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔總體積200 μL。24 h后加入含不同濃度紅車軸草總異黃酮含藥血清的培養液，終濃度分別為2.5%、5%和10%，對照組加入含大鼠空白血清的培養液，終濃度分別為2.5%、5%和10%，調零組不含細胞和藥物，每組設置6個平行孔。24 h、48 h、72 h和96 h后向培養液中加入20 μL的MTT，繼續培養4 h。棄培養液，每孔加入100 μL的DMSO，振蕩10 min以保證甲瓚全部溶解，酶標儀570 nm處測定光光密度D(λ)值，計算細胞增殖率。

1.2.4堿性磷酸酶活性測定：培養中的細胞鋪滿80%～90%瓶底后胰蛋白酶消化傳代，以5×103/孔的密度接種于96孔板中，每孔總體積200 μL。待細胞鋪滿孔底后更換為含有維生素C和β-甘油磷酸鈉的誘導性培養基，實驗組加入不同濃度的紅車軸草總異黃酮含藥血清，終濃度分別為2.5%、5%和10%，對照組加入含大鼠空白血清的培養液，終濃度分別為2.5%、5%和10%，調零組不含細胞和藥物，每組設置6個平行孔。每2 d換對應的誘導性培養液，在第3 d和第6 d按照試劑盒說明書測定堿性磷酸酶的活性。

1.2.5骨鈣素含量的測定：培養中的細胞鋪滿80%～90%瓶底后胰蛋白酶消化傳代，以5×104/孔的密度接種于24孔板中，每孔總體積1 mL。待細胞鋪滿孔底后更換為含有維生素C和β-甘油磷酸鈉的誘導性培養基，實驗組加入5%紅車軸草總異黃酮含藥血清，對照組加入5%空白大鼠血清，調零組不含細胞和藥物，每組設置3個平行孔。細胞誘導性培養后每3 d換1次培養液，每次換液保留1 mL舊培養液，于-20℃保存，連續收集第3 d、6 d、9 d、12 d 的樣品，采用ELISA法檢測骨鈣素的分泌量，以mg/L培養液表示。

1.2.6細胞礦化結節量測定：培養中的細胞鋪滿80%～90%瓶底后胰蛋白酶消化傳代，以5×104/孔的密度接種于24孔板中，每孔總體積1 mL。待細胞鋪滿孔底后更換為含有維生素C和β-甘油磷酸鈉的誘導性培養基，實驗組加入5%紅車軸草總異黃酮含藥血清，對照組加入5%空白大鼠血清，調零組不含細胞和藥物，每組設置3個平行孔。每2 d換對應的誘導性培養液，在第6 d、12 d、18 d棄去培養液，PBS清洗3次后用70%的乙醇固定1 h，蒸餾水清洗3次，加入提前配制的40 mmol/L茜素紅染液(pH=4.2)于37℃孵育10 min，再用蒸餾水清洗3次，用PBS于37℃孵育10 min，鏡下觀察礦化結節并量化。

2 結果

2.1 紅車軸草總異黃酮含藥血清對MC3T3-E1細胞增殖的影響

MTT實驗結果(圖1)表明：紅車軸草總異黃酮含藥血清各濃度組與對照組相比，作用于細胞48 h、72 h和96 h，均可顯著提高MC3T3-E1成骨樣細胞的增殖率。

圖1 細胞增殖率檢測，與空白組比較(*P<0.05 vs control.)C: 對照組; L: 低濃度組(2.5%); M: 中濃度組(5%); H: 高濃度組(10%);Fig.1 Cell proliferation rate defection.compared with the controlC: control; L: low concentration group (2.5%); M: middle concentration group (5%); H: high concentration group (10%).

2.2 紅車軸草總異黃酮含藥血清對MC3T3-E1細胞分化的影響

堿性磷酸酶(ALP)活性測定實驗結果(圖2)表明：與對照組相比，5%紅車軸草總異黃酮含藥血清作用于MC3T3-E1細胞3 d、6 d、9 d和12 d、均能顯著提高其堿性磷酸酶的活性。

圖2 相對ALP活性檢測，與空白組比較(*P<0.05 vs control.)C: 對照組; L: 低濃度組(2.5%); M: 中濃度組(5%); H: 高濃度組(10%)Fig.2 Detection of relative ALP activity.Compared with the control,(*p<0.05 vs control.).C: control; L: low concentration group (2.5%); M: middle concentration group (5%); H: high concentration group (10%)

2.3 紅車軸草總異黃酮含藥血清對MC3T3-E1細胞骨鈣素分泌的影響

ELISA法檢測骨鈣素的分泌量(圖3)表明：5%的紅車軸草總異黃酮含藥血清處理MC3T3-E1細胞6 d和9 d骨鈣素分泌量顯著高于對照組。

圖3 骨鈣素分泌檢測，與空白組比較(*P<0.05,**P<0.01 vs control.)C：大鼠空白血清對照組；TLES：紅車軸草總異黃酮含藥血清組Fig.3 Detection of osteocalcin level.Compared with the control,*P<0.05,**P<0.01 vs controlC: blank rat serum control group; TLES: serum containing the total isoflavones from t.Pratense group

2.4 紅車軸草總異黃酮含藥血清對MC3T3-E1細胞礦化的影響

茜素紅染色法測定結果(圖4)表明：5%紅車軸草總異黃酮含藥血清處理細胞6 d、12 d和18 d，形成的礦化結節數均顯著高于對照組。

圖4 A：第18 d顯微鏡下觀察的礦化結節(a：對照組4×；b：紅車軸草總異黃酮含藥血清組4×)；B：礦化結節面積的量化分析(*P<0.05 vs control.)C：大鼠空白血清對照組；TLES：紅車軸草總異黃酮含藥血清組Fig.4 Detection of relative mineralization.A: Images of mineralized nodules observed in microscope on D18.(a: control, 4×; b: serum, 4×).B: Quantitative analysis of the area of mineralization,*p<0.05 vs control.C: Blank rat serum group; TLES: serum containing the total isoflavones from t.Pratense group.

3 討論

骨重建是健康骨組織中的一個重要生理過程，其主要包括成骨細胞的骨生成過程和破骨細胞的骨吸收過程，若骨吸收過程大于骨生成，則就會形成骨質疏松癥等疾病[4]，骨質疏松癥是全球四大非傳染性致死疾病之一，直接導致患病人群的生活質量下降和一定的經濟負擔[5]。因此，篩選抗骨質疏松癥藥物并在細胞學水平進行藥效評價是非常必要的。

機體是一個復雜的系統，骨代謝受多種因素的影響，藥物在體內代謝可產生許多藥理活性產物，出現許多藥理作用。紅車軸草總異黃酮主要包括大豆苷元(daidzein)、染料木素(genistein)、鷹嘴豆芽素A(biochanin A)和鷹嘴豆芽素B(biochanin B)等。異黃酮類成分在肝臟與葡糖醛酸、硫酸結合后部分以原形排出體外。先前研究提示大豆苷元僅口服劑量的7%-30%從尿中排出和小于10%從糞便排出[6-7]，表明大豆苷元在體內進行廣泛代謝，除部分轉化牛尿酚(equol)和O-去甲基安哥拉紫檀素(O-desmethylangolensin)外，大豆苷元在肝微粒體中可發生羥化代謝，其中單羥基化代謝物為其主要代謝物[8-9]。另外，細菌也氧化部分異黃酮。因此，通過中藥血清藥理學的方法進行研究有著更重要的意義。

成骨細胞起源于多能的骨髓基質的間質細胞，在骨形成過程中經歷分裂增殖、分化成熟和基質鈣化3個階段。MC3T3-E1細胞是從C57BL/6小鼠顱頂骨細胞中建立的成骨細胞株，國際上常作為骨代謝研究的細胞模型，在細胞水平上闡明藥物防治骨質疏松癥的作用機制。本實驗應用紅車軸草總異黃酮含藥血清在細胞水平上以MC3T3-E1成骨細胞的增殖、堿性磷酸酶活性、骨鈣素生成以及礦化結節形成為指標，觀察其對體外培養的MC3T3-E1成骨樣細胞的影響。結果顯示：不同濃度的紅車軸草總異黃酮含藥血清作用于細胞48 h、72 h和96 h，均可顯著提高MC3T3-E1成骨樣細胞的增殖率(P<0.05)，并具有一定的時效關系，說明其具有促進MC3T3-E1成骨樣細胞增殖的作用。

堿性磷酸酶和骨鈣素分別是成骨樣細胞早期和晚期分化的標志，是最常見評價骨形成的指標，與對照組相比，紅車軸草總異黃酮含藥血清各濃度組在作用6 d、9 d和12 d均能顯著提高堿性磷酸酶的活性(P<0.05)；而且，5%紅車軸草總異黃酮含藥血清可顯著性促進成骨樣細胞的骨鈣素分泌，提示其能促進成骨細胞分化。

骨基質的礦化對于骨量的增加是至關重要的。它不僅是成骨細胞的重要生物學特征，也是考察藥物對成骨細胞促成骨作用的最有效方式。5%紅車軸草總異黃酮含藥血清處理細胞6 d、12 d和18 d形成礦化結節數都顯著高于對照組，提示其能促進成骨細胞礦化。

本實驗從紅車軸草總異黃酮含藥血清對MC3T3-E1成骨樣細胞的增殖、堿性磷酸酶活性、骨鈣素以及礦化等四方面進行了研究，結果顯示紅車軸草總異黃酮含藥血清不僅可以增加MC3T3-E1成骨樣細胞的增殖率，提升堿性磷酸酶的活性，還可以促進MC3T3-E1成骨樣細胞的骨鈣素分泌，進而提高成骨樣細胞的礦化水平。

綜上所述，本實驗在細胞水平觀察了紅車軸草總異黃酮含藥血清對MC3T3-E1成骨樣細胞代謝調控的影響，發現其具有促進MC3T3-E1成骨樣細胞增殖、促進細胞分化成熟、以及促進細胞礦化的作用，從而為紅車軸草總異黃酮應用于臨床治療骨質疏松癥提供了理論和實驗依據。