Th17細胞及相關因子IL-17與絕經后骨質疏松的相關性研究

劉連勇 陸志仁 游利 胡曉暉

1.上海市浦東新區浦南醫院內分泌科，200125 2.江蘇省蘇州大學醫學院研究生院，215123 3.上海市寶山區淞南社區服務中心，上海 200441 4.上海市第一人民醫院，上海 200080 5.上海市浦東新區浦南醫院脊柱外科，200125

絕經后骨質疏松癥(Postmenopausal osteoporosis，PMO)是一種由于雌激素缺乏導致骨量減少及骨組織結構變化，從而使骨脆性增多的疾病。該病主要發生在絕經后婦女，臨床上易于骨折，以及由骨折引起疼痛、骨骼變形等癥狀，嚴重地影響患者的身體健康和生活質量，甚至縮短壽命。研究認為，絕經后骨質疏松被認為可能是一種炎癥過程，許多促進炎癥和T細胞衍生的細胞因子對骨量的丟失起到了重要作用[1]。然而目前，絕經后骨質疏松癥的發病過程中的機制尚未完全清楚。

CD4+T細胞是人體免疫系統中的一種重要免疫細胞，在抗原與抗原提呈細胞(Antigen presenting cell，APC)存在時可以主要主要分化為Th1，Th2，Th17及Treg細胞[2-5]。其中，Th17細胞是一群通過產生細胞因子白介素-17(IL-17) 發揮多種生理病理學功能的細胞亞群[6]，目前的研究發現，Th17細胞通過分泌IL-17在風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA) 中起作用，并與TNF-α 共同作用時增強了骨轉換和炎癥的發展的過程[7]。此外，研究發現 IL-17 是關節炎等其他影響骨量疾病的一個很重要的介導因素，并可以作治療上述疾病的重要的靶分子[8]。然而迄今，對于Th17細胞及相關因子在絕經后骨質疏松進展中的具體作用及機制尚不完全明了。

因此，本研究通過對比絕經后骨質正常人群及絕經后骨質疏松患者的外周血Th17細胞、分泌的細胞因子以及相應的轉錄因子水平，分析探討絕經后骨質疏松患者中Th17細胞與骨密度以及血清鈣可能存在的關系。

1 對象與方法

1.1 臨床資料

選擇2011年7月～2014年7月來我院治療的60例女性絕經后骨質疏松患者為研究組，選取同期來我院體檢的60例女性絕經后骨量正常人群為對照組。絕經后骨質疏松組納入標準：①自然絕經1年以上；②年齡50-65歲，平均61 .3 歲。排除標準：①各種骨軟化癥、鈣與維生素D缺乏癥及腎小管酸中毒；②原發性、繼發性甲狀腺機能亢進；③惡性腫瘤的骨轉移；④多發性骨髓瘤；⑤脊髓血管瘤；⑥化膿性脊髓炎；⑦有明顯限制運動性疾病者，慢性內科疾病以及內分泌疾病引起繼發性骨質疏松者；⑧服用雌激素、肝素、皮質類固醇激素、二磷酸鹽等與骨質疏松有關的藥物[9]。研究組和對照組的研究對象的性別、年齡等一般資料具有可比性，差異均無統計學意義(均P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1兩組人群外周血Th17細胞流式染色：兩組人群均在早餐空腹采集外周血5 ml，加入EDTA抗凝劑，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞后，以完全1640培養液調節濃度至1×106細胞/ml。離心并重懸于100 μL PBS中，加入CD3-APC(eBioscience，0.25 mg/ml)和CD4-FITC(eBioscience，0.2 mg/ml)抗體，混勻后室溫避光孵育30 min，以PBS緩沖液洗完2遍后，加入破膜固定工作液1 ml后4度避光孵育30 min。離心后，重懸于100 ul permeabilization buffer中，加入IL-17A-PE(BioLegend，0.25 mg/ml)，4℃避光孵育45min，以PBS緩沖液洗2遍后， 500 μL緩沖液重懸細胞后用流式細胞儀(FACS Calibur，美國BD公司)檢測。

1.2.2ELISA法檢測兩組人群血清中IL-17、IL-6、TGF-β1水平：人的IL-17、IL-6、TGF-β1試劑盒均購自美國eBioscience公司，檢測流程嚴格按照試劑盒的說明書。

1.2.3采用RT-PCR法檢測兩組人外周血中轉錄因子RORγT的mRNA水平：外周血離心后提取上層血漿200 μl，加入到1 ml Trizol充分勻漿，按照說明書的要求抽提總RNA，所得RNA溶于30μl DEPC水中。提取的總RNA經紫外分光光度計進行定量分析。然后再采用Femantes逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，于-20℃保存備用。本實驗PCR反應條件：95℃變性20 s，然后60℃20s和70℃1 s進行40個循環。RORγT引物序列：正義序列：5’-GCAGCGCTCCAACATCTTCT-3’， 反義序列：5’-ACGTACTGAATGGCCTCGGT-3’；內參GAPDH引物序列：正義序列：5’-GCATGGGTCAGAAGGAT TCCTc-3’， 反義序列：5’-TCGTCCCAGTTGGTG ACGAT-3’。使用ABI公司的7300型號Real-Time PCR儀器進行擴增，所得結果采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析[10]。

1.3 骨密度測量

應用美國通用PRODIGY雙能X線吸收儀檢測測定 L1-4椎體、股骨頸、橈骨遠端的骨密度BMD值，以面積骨密度值準確性(0.5%-1%)g/cm表示。腰椎1-4，股骨頸和橈骨遠端檢測的變異系數(CV)分別為1.2%，1.2%，1.4%。

1.4 統計學及作圖分析

所有數據采用SPSS19.0軟件統計分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，相關分析采用Pearson相關分析法。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 絕經后骨質疏松患者及對照人群外周血Th17細胞水平比較

流式細胞術檢測顯示，絕經后骨質正常對照組人群外周血中Th17細胞比例為(0.67±0.39)%，顯著低于絕經后骨質疏松患者中的Th17細胞比例(2.10±0.83)%，差異有統計學意義(t=12.08,P=0.000)。提示Th17細胞可能參與絕經后骨質疏松的發展。見圖1。

圖1 兩組人群外周血中Th17細胞比例(***，P<0.001)Fig.1 The proportion of Th17 cells in peripheral blood in the two groups.

圖2 兩組人群外周血血清中IL-17蛋白水平及外周血RORγT的mRNA水平Fig.2 The levels of serum IL-17 protein and RORγT mRNA in peripheral blood in the two groups.

2.2 絕經后骨質疏松患者及對照人群血清中IL-17及外周血中轉錄因子RORγT的mRNA水平

ELISA結果顯示，絕經后骨質正常對照組人群外周血中IL-17水平為(19.51±11.21)pg/ml，顯著低于絕經后骨質疏松患者血清中IL-17水平(27.54±10.48)pg/ml，差異有統計學意義(t=4.05,P=0.000)。RT-PCR檢測結果顯示，與絕經后骨質正常對照組人群比較，絕經后骨質疏松患者外周血RORγT mRNA水平顯著高于正常人群，差異有統計學意義(t=15.12，P=0.001)。提示了Th17細胞可能通過激活轉錄因子RORγT以及分泌細胞因子IL-17及來參與絕經后骨質疏松的發展。見圖2。

2.3 絕經后骨質疏松患者及對照人群外周血血清IL-6及TGF-β水平比較

ELISA結果顯示，絕經后骨質正常對照組人群外周血血清中IL-6水平顯著低于絕經后骨質疏松患者，差異有統計學意義(t=8.99,P=0.000)；此外，絕經后骨質正常對照組人群外周血中TGF-β水平顯著低于絕經后骨質疏松患者，差異有統計學意義(t=4.71,P=0.000)，見表1。

表1 兩組外周血血清中IL-6及TGF-β的關系Table 1 Relationship between serum IL-6 and TGF-β

注：與對照組比較，△t=8.99,P=0.000；▼t=4.71,P=0.000

2.4 絕經后骨質疏松患者及對照人群外周血中Th17細胞與骨密度的關系

與對照組比較，絕經后骨質疏松患者的BMD顯著降低，差異有統計學意義(t=6.14，P=0.000)，見表2。進一步Pearson相關分析顯示，絕經后骨質疏松患者血清中IL-17與骨密度呈顯著負相關(r=0.671，P<0.05)。見圖3。

表2 兩組外周血中Th17細胞與骨密度的關系Table 2 Relationship between Th17 cells in peripheral blood and bone mineral density.

注：與對照組比較，△t=6.14，P=0.000。

圖3 絕經后骨質疏松患者血清中IL-17與骨密度的相關分析Fig.3 Correlation analysis of serum IL-17 and BMD in PMOP patients

3 討論

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是多種原因引起的一類以骨量減少、骨的微觀結構破壞，從而導致骨的脆性增加，易發生骨折為特征的一種全身代謝性骨骼疾病。隨著近年來社會的老齡化以及生活水平的提高，骨質疏松癥的患病率逐年增加。目前的研究認為，骨質疏松癥的發病的誘導機制主要包括雌激素缺乏、維生素C、D缺乏、甲狀腺功能亢進癥以及胃腸吸收功能障礙等[11, 12]。絕經后骨質疏松癥是一種因絕經后卵巢合成雌激素減少導致骨質疏松癥。研究發現，婦女絕經后機體內的細胞因子，如IL-1、TNF-α、IL-6 和巨噬細胞集落刺激因子的表達水平顯著增加，并與骨丟失密切相關[13, 14]。

IL-17是一類主要由Th17細胞誘導下產生的細胞因子，IL-17在抵抗胞外病原體感染的宿主防御以及各種自身免疫性疾病發病中發揮極其重要的作用[15, 16]。在骨關節炎模型研究發現，IL-17可以通過與 TNF-α的協同作用共同參與關節炎的炎癥反應及骨轉換過程[7]。DeSelm CJ等在小鼠模型中發現，經歷卵巢切除術(OVX)的野生型小鼠由于雌激素缺失可以導致骨小梁減少，而IL-17受體缺失的小鼠卻具有較完整的骨小梁[17]，從而提示了IL-17在雌激素缺失的小鼠中可能具有促進骨質疏松作用。本研究通過對人群樣本研究發現，在絕經后骨質疏松患者外周血中Th17細胞及IL-17水平顯著高于對照人群，提示Th17細胞可能通過產生IL-17參與絕經后骨質疏松的免疫應答，這與以往研究發現的產生IL-17的Th17細胞在雌激素(estrogen，E2)缺失的小鼠體內水平增加與骨丟失一致的結果相符[18]。我們進一步檢測了RORγT的mRNAs水平，該指標是Th17細胞功能的關鍵轉錄因子[19]，結果發現，絕經后骨質疏松患者血清中RORγT的mRNA水平均高于對照人群，從而進一步驗證了以上結果。由于轉化生長因子β(TGF-β)和IL-6在誘導T細胞向Th17細胞分化的過程中發揮重要的作用[20]，因此，本研究亦觀察了絕經后骨質疏松患者體內以上兩種細胞因子水平，結果亦發現，在絕經后骨質疏松患者外周血中TGF-β及IL-6水平顯著高于對照人群。Islander U 等學者在類風濕性關節炎小鼠模型中發現的IL-6 具有促骨質疏松特性[21]，且Grainger, D.J等學者發現TGF-β在美國的骨質疏松婦女血清中表達增加[22]，均支持了本研究的結果。

目前關于Th17分泌的IL-17影響絕經后骨質疏松的機制尚未完全明了，因此，我們通過分析了絕經后骨質疏松患者體內IL-17水平與骨密度的關系，探討IL-17對于絕經后骨質疏松的影響機制。結果發現，絕經后骨質疏松患者血清中IL-17越高，骨密度越低，從而提示了IL-17可能通過影響骨密度參與絕經后骨質疏松發病的過程。

綜上所述，Th17細胞及其相關因子在絕經后骨質疏松致病中發揮著重要的功能，Th17細胞及其相關因子的增加，可能是促進絕經后骨質疏松發生的重要原因，降低絕經后骨質疏松患者體內增加的IL-17可能對絕經后骨質疏松治療及預后具有重要的臨床意義。