不同牽張應力對成骨細胞MC3T3-E1分化及Wnt信號轉導通路的影響研究

陳熙 郭健民 元宇 張玲莉 吳雋旎 孫忠廣 陳炳霖 鄒軍

1.上海體育學院運動科學學院，上海 200438 2.溫州醫(yī)科大學體育科學學院，溫州 325035 3.上海體育學院發(fā)展規(guī)劃處，上海 200438

在人體內，成骨細胞和破骨細胞的動態(tài)平衡維持了體內的骨量[1]。機械應力刺激則是其平衡的重要調節(jié)因素，在骨生長和骨重建過程中發(fā)揮著重要的作用。較多的研究指出，各種機械應力如剪切力、牽張力、壓力等都可以對骨細胞以及成骨細胞進行刺激，并促進成骨增殖和分化[2-4]。但是不同的應力強度，頻率及刺激時間對成骨細胞的影響也不同，不適宜的牽張力則不利于成骨分化，甚至還會引起細胞凋亡[5]。另外，研究也指出，Wnt信號轉導通路在骨的生長發(fā)育以及應力影響成骨分化中具有重要作用[1, 6]。因此，本研究采用不同強度和時間對MC3T3-E1細胞進行機械牽張干預，觀察牽張應力對成骨細胞分化及Wnt信號轉導通路的影響，探討促進成骨分化的適宜機械牽張應力及其機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與主要試劑

Flexcell-FX5000細胞力學系統(tǒng)；細胞培養(yǎng)箱(Thermo，USA)；熒光定量PCR儀(ABI StepOne 7300，USA)；蛋白電泳儀、(BioRad，USA)；酶聯(lián)免疫檢測儀(BioTek，USA)；α-MEM(Hyclone，USA)；胎牛血清(FBS)(Gibco，Australia)；0.25%胰酶、青霉素、鏈霉素、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(碧云天)；抗壞血酸L、β-甘油磷酸鈉(Sigma，USA)；Trizol、逆轉錄試劑盒；SYBR熒光定量試劑盒(Takara，寶生物)；β-actin、Phosphor-33/37-β-catenin(cell signal technology, USA)；Wnt1、β-catenin(abcam，USA)；引物合成于上海生物工程技術服務公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

成骨細胞系MC3T3-E1(ATCC，CRL-2594)復蘇后采用α-MEM培養(yǎng)液(含10%FBS+100 U/ml青霉素+0.1 mg/ml鏈霉素)，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)細胞培養(yǎng)。每3天換一次液，細胞長至70-80%融合時進行傳代。

1.3 施加牽張應力

生長良好的MC3T3-E1細胞，在胰酶消化后進行重懸，調整至1×105濃度接種于Flexcell公司生產的底部具有彈性模的專用6孔板(BioFlex? Plate彈性膜6孔板)，正常培養(yǎng)2d后，換成含誘導分化劑的培養(yǎng)液(含抗壞血酸L、β-甘油磷酸鈉)后對細胞進行牽張應力的干預(Flexcell-FX5000 tension System，USA)。分別采用3%，6%，12%的形變幅度的正弦波，0.5 Hz的頻率，牽拉時間分別為2，4，8 h，對照組細胞不進行干預正常培養(yǎng)。在實驗結束后即刻收集細胞。每組3個孔，實驗重復3次以上。

1.4 ALP活性測定

牽張應力干預結束后吸除孔內培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，每孔加入的0.2% TritonX-100 2ml裂解細胞后置于4℃過夜制備樣本，按照ALP檢測試劑盒說明檢測ALP活性：每孔取10 ul細胞裂解液放入96孔細胞培養(yǎng)板(以加PBS的空白管做空白對照)，之后分別加入40 ul檢測緩沖液和50 ul顯色底物，混勻后于37℃孵育10 min，加入100 ul反應終止液終止反應。在405 nm波長下測定吸光度值(BioTek酶標儀)，并減去空白對照管吸光度值后進行統(tǒng)計分析。

1.5 Real time-PCR分析

采用Trizol提取每孔細胞的總RNA，測定RNA濃度后按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA，然后對cDNA進行SYBR熒光定量擴增分別檢測骨鈣蛋白(Osteocalcin，OC)、Runx2、Osterix、Wnt1、β-catenin、DKK-1、GAPDH mRNA的表達(各基因引物設計見表1)，采用兩步法行40個循環(huán)。每個樣本設3個復孔，取均值得出Ct值，以GAPDH為內參，采用2-△△Ct計算出所有指標mRNA的相對表達量。

表1 各基因引物設計Table 1 Design of gene primers

1.6 Western blot檢測

牽拉干預結束后加4℃預冷的PBS洗3次，每孔加入100 ul的RIPA(碧云天)裂解液后用刮刀收集細胞于EP管，之后于4℃冰上裂解細胞30 min，12000 rpm 4 ℃離心10 min，提取上清液即為細胞總蛋白，采用BCA試劑盒對蛋白濃度測定并調平蛋白濃度，與SDS-PAGE上樣緩沖液(6×)按5∶1混合，100℃煮沸10 min，分裝后-20℃保存。進行Western blot檢測時采用8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠使蛋白分離后，以300 mA恒流電轉2 h。PVDF膜在5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，一抗于4℃孵育過夜，TBST洗三次后采用HRP結合的二抗室溫孵育2 h，TBST洗三次后采用ECL發(fā)光液于暗室顯影，并用膠片進行掃描后保存。采用image J軟件對所有條帶進行灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，結果以均數(shù)±標準差表示， 先用雙因素方差分析強度和時間因素對成骨分化的作用，再采用單因素方差分析分別對時間因素和強度因素進行分析，用Bonferrori法進行組間兩兩比較。以P<0.05為具有顯著性差異。

圖2 各強度組不同時間牽拉干預后OC、Runx2和Osterix mRNA的相對表達Fig.2 The expression of OC.Runx2 and Osterix mRNA in different mechanical loading and duration groups.

圖3 各強度組不同時間牽拉干預后Wnt1、β-catenin和DKK-1 mRNA的相對表達Fig.3 The expression of Wnt1, β-catenin, and DKK-1 mRNA in different mechanical loading and duration groups.

圖1 各強度組不同時間連續(xù)牽拉干預后ALP活性值Fig.1 ALP results in different mechanical loading and duration groups

2 結果

2.1 ALP活性

如圖1所示，3%和6%強度的牽拉均可以增加MC3T3細胞的ALP活性，其中6%強度的應力刺激ALP活性升高的幅度更大，而12%強度的牽拉組的ALP活性出現(xiàn)下降的趨勢，在8 h連續(xù)干預時有統(tǒng)計學差異。在時間效應上，3%和6%強度組均在4 h時ALP活性達到峰值，8 h時略有下降。

2.2 mRNA表達水平變化

如圖2所示，3%和6%強度的連續(xù)牽拉干預均使成骨細胞OC和Runx2的mRNA表達增加，6%強度增加的幅度大于3%強度。6%強度的牽拉干預還可以使Osterix mRNA的表達增加，而3%強度無統(tǒng)計學差異。在時間效應上，兩組OC、Runx2和Osterix mRNA表達的峰值均在4 h時。另外12%強度的連續(xù)牽拉干預后Runx2和Osterix mRNA的表達沒有統(tǒng)計學差異，而OC mRNA的表達減少了，在4-8 h的干預后減少的幅度最大。

如圖3所示，3%和6%強度的連續(xù)牽拉干預后，成骨細胞Wnt1和β-catenin的mRNA表達均升高，6%強度組的升高幅度大于3%強度組，且在4h時升高的幅度最大；DKK-1 mRNA的表達則降低了，6%強度時2 h就開始有顯著下降，而3%強度時則到4 h時有統(tǒng)計學差異。12%強度牽拉干預后Wnt1、β-catenin 和DKK-1 mRNA的表達均無顯著性差異。

2.3 蛋白表達水平變化

如圖4所示，3%和6%強度的連續(xù)牽拉干預后，成骨細胞的Wnt1和β-catenin的蛋白均增加了，P-β-catenin蛋白(失活狀態(tài)的β-catenin)則出現(xiàn)下降趨勢，故β-catenin/P-β-catenin的比值顯著升高，且6%強度增加的幅度大于3%強度，4小時干預的增加幅度最大。 12%強度干預后，成骨細胞的Wnt1蛋白和β-catenin/P-β-catenin的比值均出現(xiàn)下降趨勢，在4 h和8 h干預后差異有統(tǒng)計學意義。

圖4 各強度組不同時間牽拉干預后Western blot代表圖和蛋白相對表達量Fig.4 The protein expression and representing Western blot chart in different mechanical loading and duration groups

3 討論

在人體內，骨對機械應力刺激具有適應作用，在應力高的區(qū)域則骨形成大于骨吸收，相反在減少應力的作用下，則會引起人體骨量的丟失，如長期臥床病人，宇航員，減肥等[7]，因此，機械力學刺激對骨代謝具有重要的調節(jié)作用。較多的研究指出，骨髓間充質干細胞、成骨細胞和骨細胞都可以感受外界的機械應力刺激，并做出應答[8-10]。而機械應力的方式、刺激強度大小、頻率等均會對細胞產生不同的影響。近些年，國內外采用牽張應力對成骨細胞進行機械干預成為研究的熱點，故本研究采用牽張力為干預方式，采用了國際上公認的Flexcell細胞應力加載系統(tǒng)對細胞進行周期性牽張應力刺激。

本次研究發(fā)現(xiàn)，在中低強度(3%-6%強度)的應力刺激可以促進MC3T3細胞ALP的分泌，同時促進OC、Runx2、Osterix mRNA的表達。ALP的是成骨細胞早期分化的標志，OC是成骨細胞向礦化發(fā)生期分化的標記之一，是其晚期分化的標志，說明中低強度的牽張應力刺激可以促進成骨細胞的分化。Runx2和Osterix則是成骨細胞分化所必需的關鍵轉錄因子，在骨髓間充質干細胞向成骨分化的過程中扮演了重要的角色[11, 12]。本次研究中，Runx2和Osterix的mRNA表達水平的升高也說明了牽張應力有較好促進成骨分化作用，與Zhong等人的研究結果一致[4]。

高強度(12%)牽張應力刺激后MC3T3細胞的ALP分泌減少，OC mRNA表達水平下降，提示高強度的機械刺激不利于成骨細胞分化。Koike等對ST2細胞系進行牽張應力干預后也發(fā)現(xiàn)，高強度應力(10%和15%)刺激后細胞的ALP活性出現(xiàn)下降趨勢[13]。Jacobs等對HOB成骨細胞系進行10%的牽張應力干預也發(fā)現(xiàn)細胞的ALP活性下降，OPG mRNA表達下降[14]，與本次實驗結果一致。但李菲菲等的研究也發(fā)現(xiàn)，12%的牽張應力刺激可以促進Sao-2成骨細胞系ALP活性和OC mRNA的表達增加，促進成骨分化[15]。考慮可能是不同細胞系對應力刺激的敏感性和耐受性不同，因此細胞適應的生理刺激強度也會因細胞的不同而有所變化。

另外，有研究指出高頻率牽張應力會使成骨細胞分化減少，故本研究采用0.5Hz的實驗方案[16]。時間效應上，本次研究顯示中小強度牽張應力干預2h，4h時，成骨細胞的分化隨著干預時間的增加而增加，但是8h牽張干預后比起4h干預各項成骨分化指標均呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能是長時間機械應力刺激可能會超過細胞所能承受的生理刺激范圍，有部分細胞出現(xiàn)凋亡甚至死亡的現(xiàn)象。而在12%強度牽張應力刺激后，成骨細胞分化的各項指標則隨著時間的增加下降。Koike等對ST2細胞進行24h和48h的連續(xù)干預后也發(fā)現(xiàn)，5%、10%和15%強度牽張應力均使細胞的Runx2表達減少[13]，與本次研究結果一致。

有研究指出，多個細胞信號傳導通路參與了成骨細胞分化的過程，其中經典Wnt信號轉導通路通過上調細胞內β-catenin的活性，在成骨細胞和骨髓間充質干細胞的成骨分化過程中發(fā)揮著極為重要的作用[1]。如穩(wěn)定表達Wnt1、Wnt3a可促進C3H10T1/2細胞系的增殖, 并誘導上調成骨細胞ALP的活性[17]。Phosphor-33/37-β-catenin則是β-catenin的失活狀態(tài)，故常用β-catenin/Phosphor-33/37-β-catenin的比值來反映Wnt信號路通的激活狀態(tài)。DKK-1可以通過和Lrp5/6結合競爭性抑制Wnt蛋白，下調Wnt信號通路，從而抑制成骨細胞的增殖和分化[18]。

本研究結果顯示，3%和6%強度的牽拉可以促進成骨細胞Wnt1和β-catenin mRNA的表達，并且減少DKK-1 mRNA的表達。而12%強度的牽拉刺激后這三項指標則均無顯著性變化。提示3%和6%強度牽張刺激可以上調MC3T3細胞Wnt信號轉導通路，而12%強度則無該效應，甚至DKK-1 mRNA表達水平略有上升。Wnt1蛋白表達以及β-catenin/P-β-catenin比值的結果與PCR結果相符，顯示牽張應力刺激上調了Wnt信號轉導通路，且上調的強度和時間效應與成骨細胞分化的各項指標相一致，提示機械應力(牽張力)可能通過上調細胞內Wnt信號轉導通路，促進成骨細胞分化。

綜上所述，中小強度的牽張應力刺激可以上調MC3T3細胞的Wnt信號轉導通路，促進細胞成骨分化，以6%強度，4 h干預時效果最為顯著；大強度(12%)或者長時間(8h)則不利于細胞成骨分化，甚至還有抑制作用。