健骨方治療膝骨關節(jié)炎療效機制的實驗研究

何偉 李博寧 李同生 楊功旭 黎祥勝 彭靜

1.湖北省中醫(yī)院，武漢 430070 2.湖北中醫(yī)藥大學

膝關節(jié)退行性骨關節(jié)炎(KOA)多見于中老年人，是損害人類健康，影響人口勞動力和生活質量的一個嚴重疾病，造成巨大的社會和家庭負擔[1]，其發(fā)病機制尚不清楚。最近研究表明p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號轉導通路在OA的發(fā)病中也扮演著重要的作用[2]。

祖國醫(yī)學認為膝關節(jié)骨性關節(jié)炎屬于“痹證”、“痛痹”、“骨痹”、“鶴膝風”等范疇。本研究應用名老中醫(yī)李同生祖?zhèn)髅胤浇」欠街委煷笫笙ス切躁P節(jié)炎。我們采用大鼠前交叉韌帶切斷(ACLT)方法建立OA模型[3],觀察健骨方干預大鼠膝骨關節(jié)炎p38MAPK信號傳導通路的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組

SD清潔級大鼠40只，4個月齡，重達200±20 g，雌雄比例1∶1，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供(許可證號：SCXK(鄂)2010-0009)。將雌雄大鼠隨機分成四組，隨機分為正常組、模型組、健骨方組、陽性對照組。各組動物均在同一條件下雌雄分籠飼養(yǎng)，進食普通飼料，自然光照，溫度20℃±2℃，濕度50%左右，與實驗前適應喂養(yǎng)1周。

1.2 實驗藥物的配制

臨床患者一日一劑的健骨方總重為146 g，患者體重70 kg，則患者日用量為2.086 g/kg。據(jù)體表面積等效劑量換算公式[4]：D1=D2×R1/R2×(W2/W1)1/3,計算出SD大鼠等效劑量為13.45 g健骨方/kg。陽性對照藥等效劑量為18.43 mg/kg。

制法：為保證中藥有效成分含量，與患者煎藥一樣。健骨方1付，加水沒過藥物2橫指，先煎猴骨等藥物30 min，在下其他中藥煮沸后文火煎煮20 min，過濾。繼續(xù)在中藥中加水沒過藥物2橫指，煮沸后20 min過濾。混合二次藥液，此法共煎10劑，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

陽性對照藥配制：取塞來昔布膠囊內容物18.43 mg，5%CMC研磨配制成100 ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動物處理方法

正常組為假手術組對照。其他三組采用Hulth法[3]建立大鼠膝OA模型。術中注意避免損傷關節(jié)面軟骨。術后大腿外側肌注青霉素8萬U，連續(xù)3 d。術后第二天，動物飲食飲水正常，跛行，傷口無感染。術后第3天開始，每日驅趕30 min，持續(xù)驅趕2 m。而后對應組灌胃給藥，喂藥3月后處死大鼠，取出患側關節(jié)軟骨進行檢測。實驗期間不限制飲食，允許其在籠內自由活動。

1.4 實驗步驟

1.4.1電泳：取適量RIPA裂解液勻漿組織，測蛋白濃度后，各樣品取50 ug總蛋白上樣電泳，根據(jù)蛋白分子量配制12%的PAGE膠電泳。根據(jù)預染marker顯示，判斷目的蛋白得到充分分離后，停止電泳。

1.4.2轉膜(濕轉法)：取出凝膠根據(jù)Marker切下目的條帶，用蒸餾水沖洗，剪與PAGE凝膠相同大小的PVDF膜和濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡數(shù)秒后和濾紙一同浸泡于電轉緩沖液中。按照黑色板-纖維墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-纖維墊-白色板依次放好，夾緊板后放入轉膜儀內，黑色板的一面對照黑色負極。轉膜條件：p38-200 mA，100 min。

1.4.3封閉：用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2 h。

1.4.4一抗：用封閉液稀釋相應的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜。p38-1∶400稀釋。

1.4.5二抗：TBST充分洗滌PVDF膜5-6次，5 min/次。用封閉液稀釋相應的HRP標記二抗-1∶80 000稀釋，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫搖床孵育2 h。

1.4.6顯色曝光：TBST充分洗滌PVDF膜5-6次，5 min/次。每張膜滴加適量的底物液，孵育數(shù)分鐘。待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后放入顯影液顯影、定影液定影。

1.4 觀察指標

觀察膝骨關節(jié)炎大鼠P38表達變化。

1.5 實驗數(shù)據(jù)處理

應用SPSS 12.0版統(tǒng)計軟件(SPSS INC)統(tǒng)計學處理，單因素方差分析。

2 結果

試驗結果顯示，p38 MAPK 磷酸化產(chǎn)物在模型組持續(xù)表達，而在健骨方組的 p38 MAPK 磷酸化產(chǎn)物的表達呈下降趨勢，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 健骨方對各組膝骨關節(jié)炎大鼠P-38表達的影響Table 1 The effect of Jiangu recipe on expression of p38 MAPK in knee osteoarthritis rats

注：模型組與正常組比較，給藥組與模型組比較*P<0.05
Ps：Compared Model group with normal group，compared Dose group with normal group*(P<0.05)

圖1 不同組別大鼠P-38的表達結果(western)Fig.1 The result of p38 MAPK expression in rats

3 討論

1995年,在國際骨性關節(jié)炎專題會議上提出了骨性關節(jié)炎的最新定義[4],即骨性關節(jié)炎是在力學因素和生物學因素的共同作用下,軟骨細胞、軟骨基質及軟骨下骨三者間分解和合成代謝失衡的結果。骨性關節(jié)炎的發(fā)病基礎來自軟骨的損傷,關節(jié)軟骨損傷是啟動骨性關節(jié)炎的首要因素。炎癥介質、基質和機械應力通過軟骨特定的受體,轉導這些信號到細胞核,啟動基質分解酶和炎性基因,但目前骨性關節(jié)炎具體發(fā)病機制尚還沒有很充分的闡明，本課題主要認為OA發(fā)病過程中起主要作用的炎性介質IL-1β和TNF-α通過激活關節(jié)軟骨p38絲裂原活化蛋白激酶信號轉導通路轉導途徑來發(fā)揮作用[11,12]，健骨方中的有效成分能夠減少P38的表達從而保護膝關節(jié)軟骨。

p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號轉導通路廣泛存在真核細胞內的應激活化蛋白激酶,是細胞外引起細胞核內反應的通道之一。此信號通路在炎癥反應(軟骨炎性細胞因子的產(chǎn)生)、細胞的生長分化(軟骨細胞表型的保持和分化，軟骨細胞的肥大化、鈣化、凋亡以及軟骨基質金屬蛋白酶的合成)過程中具有重要作用，在OA的發(fā)病中扮演著重要的角色[5，7，10]。p38信號通路在關節(jié)軟骨的破壞中可能處于一個樞紐地位，阻斷或減少p38的表達會對軟骨起到保護作用[9]。

p38可分為p38α、p38β、p38γ和p38δ等4種，在各種組織中的含量不一。一般所說的p38即是指p38α，普遍存在于各種組織中[8]。p38靜息狀態(tài)主要散在分布于細胞漿，炎癥信號激活后轉移至細胞核內[6]，從而啟動基質分解酶和炎性基因。被炎性介質IL-1β和TNF-α激活后能再通過調節(jié)激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)轉錄因子調節(jié)MMPs的表達，激活MMP-1、MMP-3、MMP-8、MMP-9的活性，加速膠原的病理性降解[13，14,15]，從而造成關節(jié)軟骨損傷。綜上所述，在OA發(fā)病早期，受損的軟骨細胞在周圍炎癥因子的作用下激活p38的表達，p38被炎癥因子激活后通過調節(jié)激活蛋白-1轉錄因子調節(jié)MMPs的表達，MMPs降解軟骨基質，使關節(jié)軟骨的完整性破壞，削弱軟骨抵抗外界機械應力的能力，造成惡性循環(huán)使軟骨細胞更易暴露于眾多炎性因子的攻擊之下，使軟骨基質成分游離出軟骨，軟骨破壞，最終導致軟骨質量不斷下降和進行性退化，因而通過影響p38 MAPK的表達，從而對軟骨細胞退變起到干預作用。

本實驗結果表明，中藥復方健骨方能有效影響p38 MAPK表達水平，從以上研究結果可以看出，膝骨關節(jié)炎的發(fā)病與p38MAPK介導的細胞信號通路密切相關，通過在信號通路水平干預和調控p38MAPK的表達和活性，將有希望成為治療膝骨關節(jié)炎的有效途徑。此外，健骨方治療膝骨關節(jié)炎的機制與調節(jié)p38MAPK這一細胞信號轉導通路密切相關。中藥復方健骨方是李同生教授經(jīng)過多年臨床實踐，治療寒熱骨痹、治虛治實、治氣治血等多功效和雙相作用。

本研究通過研究健骨方影響p38MAPK信號傳導通路，闡明健骨方治療膝骨關節(jié)炎的療效與機制，為臨床更加合理有效的治療膝骨關節(jié)炎提供了理論依據(jù)。