劃痕損傷對大鼠大腦皮層微血管內皮細胞N F-κB表達及繼發性死亡的影響*

黃梓雄，陳兵，聶麗容，林亨，莫偉，尹延慶，梁遠生

（廣東醫學院附屬醫院，廣東 湛江 524001）

劃痕損傷對大鼠大腦皮層微血管內皮細胞N F-κB表達及繼發性死亡的影響*

黃梓雄，陳兵，聶麗容，林亨，莫偉，尹延慶，梁遠生

（廣東醫學院附屬醫院，廣東 湛江 524001）

目的通過體外培養SD大鼠大腦皮層微血管內皮細胞并制作劃痕損傷模型，觀察劃痕損傷對腦微血管內皮細胞N F-κB表達及其自噬、凋亡和壞死的影響。方法體外培養SD大鼠大腦皮層微血管內皮細胞并制作劃痕損傷模型，應用N F-κB抑制劑吡咯醛二硫氨基甲酸（PD TC）干預劃痕損傷腦微血管內皮細胞。隨機分為對照組、單純損傷組、損傷+抑制組，在不同時間點（損傷后1、6、12、24及48 h）分別應用免疫熒光細胞化學法測定磷酸化N F-κB p65蛋白的表達，Annexi n V/PI染色法檢測凋亡、壞死，W es t ern bl ot檢測自噬蛋白LC 3Ⅱ表達情況。對照組為無劃痕損傷的腦微血管內皮細胞。結果腦微血管內皮細胞劃痕損傷后N F-κB蛋白表達于傷后1 h開始表達增強，于24 h達高峰，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。凋亡、壞死及自噬各指標均隨時間推移有不同程度升高，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。而經PD TC處理后上述變化均受不同程度的抑制，與單純損傷組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。結論劃痕損傷后可激活腦微血管內皮細胞N F-κB表達，同時可引起腦微血管內皮細胞的自噬、凋亡和壞死。

劃痕損傷；腦微血管內皮細胞；N F-κB；吡咯醛二硫氨基甲酸

大腦內有極豐富的毛細血管網，整個人腦的微血管內皮表面積約20 m2。腦微血管內皮細胞（brai n m i crovascul ar endot hel i al cel l s，BM EC）是血腦屏障的最主要成分，具有特有的形態結構及功能特征。不僅在基因、蛋白質組水平上與其他內皮細胞有明顯差異［1］，而且具有細胞間緊密連接、高跨內皮阻抗、缺乏窗孔結構、極少的胞飲小泡以及選擇性雙向跨細胞膜轉運系統等獨有的特征［2］，使血腦屏障成為一個限制大多數極性分子和蛋白質運動的選擇性低滲透性屏障［3］。以往忽視了BM EC在中樞神經系統中的重要作用，隨著“血管神經單元（neurovascul ar uni t）”概念的提出并對腦血管疾病的深入研究，逐漸認識到神經元、膠質細胞與BM EC的伙伴關系，BM EC可以膠質細胞為橋梁與神經元進行信息交流發揮重要作用。但目前對BM EC機械性損傷的研究較少，BM EC在腦損傷后多條信號傳導通路被激活，而NF-κB所參與的信號傳導通路的作用還有待進一步探討。本實驗通過制作大鼠BM EC的體外劃痕損傷模型，從而消除在體時炎癥、缺血、感染等多種因素的干擾，研究劃痕損傷對BM EC內NF-κB表達以及自噬、凋亡、壞死的影響，探討腦損傷后BM EC繼發性死亡的機制，為治療腦損傷尋求新的治療策略。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物SPF級健康新生SD大鼠80只，鼠齡24 h，不限雌雄，重量5～8 g，購自廣東醫學院動物實驗中心，分批實驗。

1.1.2主要試劑胎牛血清（FBS）、DM EM培養液、0.25%胰蛋白酶購自Gi bco公司，PDTC、NF-κB免疫熒光試劑盒、SDS購自Si gm a公司，FITC Annexi n V Apopt osi s Det ect i on ki t凋亡試劑盒購自BD公司，兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體、FITC標記山羊抗兔IgG為Abcam公司產品，兔抗鼠磷酸化NF-κB p65單克隆抗體、兔抗鼠LC3B單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG為Cel l Si gnal i ng公司產 品 ，PVDF膜 （PVDF0.22μm） 為 M i l l pore Bi ot echnol ogy公司產品。

1.1.3主要儀器Therm o細胞培養箱，Lei ca倒置顯微鏡，Lei ca激光掃描共聚焦顯微鏡，BD流式細胞儀，Kodak X光自動洗片機，Seri al垂直轉移電泳槽。

1.2方法

1.2.1腦微血管內皮細胞的原代培養、純化及鑒定

參照文獻［4］的方法并加以改良進行體外原代培養及純化SD大鼠大腦皮層BM EC：取24 h內新生SD大鼠75%的酒精浸泡消毒，在無菌冷凍條件下取大腦皮質，剝離腦膜及血管血塊，將腦皮質置于DM EM培養液中剪碎成1 m m3的小塊，移入15 m l離心管，加入DM EM至2 m l，加0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）2 m l，37℃消化10～20 m i n，持續震搖。加入終濃度為10%的胎牛血清終止消化，1 000 r/m i n離心5 m i n，棄上清。加含胎牛血清的DM EM洗滌2次，吸管輕輕吹打，棄去經200目不銹鋼網過篩的濾液，用DM EM液反復沖洗下濾網上的組織。經100目不銹鋼網過篩并收集濾液，1 000 r/m i n離心5 m i n，棄上清液。加入0.1%Ⅱ型膠原酶1～2 m l（用量據組織多少而定），37℃水浴震蕩消化15～25 m i n，加入含血清培養基終止消化后，吹打使混勻，1 000 r/m i n離心5 m i n，棄上清液。加完全培養基后輕輕吹打使其混勻，接種于已鋪有明膠的培養皿上，靜置于37℃、5%二氧化碳的培養箱內培養24 h后換培養液。之后每隔2～3 d更換培養液，約7～10 d見細胞融合鋪滿時即可進行純化傳代。純化傳代：選取培養至近融合狀態的細胞，吸棄原培養基，予37℃預熱的DM EM液清洗2遍，加入1∶1的0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化液，置培養箱中37℃消化1～2m i n。在相差顯微鏡下觀察，見大部分細胞收縮變圓、間隙增大時，即刻加入1～2 m l完全培養基終止消化，用移液器輕輕吹打使細胞脫壁，收集細胞懸液，1 000 r/m i n離心5 m i n，棄上清。加完全培養基，混勻后按照1∶2接種于2個細胞培養皿內，孵育4 h取出，吸去未貼壁的細胞并更換完全培養基，置培養箱內繼續培養至細胞重新生長至融合狀態時，重復上述操作處理2～3次，便可得到純度較高的大鼠BM EC。鑒定：將已純化好的細胞消化傳代接種于放有細胞培養專用蓋玻片的12孔培養板中，至細胞生長至80%～90%匯合狀態時，吸除培養液，用PBS洗滌1次，加入固定液固定5～15 m i n，吸除固定液，用洗滌液洗3次，每次3～5 m i n，滴加免疫染色封閉液至充分蓋住樣品，室溫封閉1 h，吸去免疫染色封閉液，滴加1 m l兔抗大鼠第Ⅷ因子相關抗原抗體（抗體用一抗稀釋液稀釋，1∶100），用一抗稀釋液代替一抗作為陰性對照，37℃孵育1 h或4℃孵育過夜。吸出一抗，洗滌液洗3次，每次5～10 m i n，加入FITC標記的羊抗兔IgG 1 m l（二抗稀釋液稀釋，1∶100），室溫孵育1 h。吸出二抗，洗滌液洗滌2次，每次5～10 m i n；加入細胞核染色液（PI）使充分蓋住樣品，室溫染色5 m i n左右，吸除細胞核染色液，用洗滌液洗滌3次，每次3～5 m i n；加適量抗熒光淬滅封片液并用蓋玻片封片，應用激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀察。胞漿中第Ⅷ因子相關抗原的染色為綠色熒光，細胞核的PI染色為紅色熒光。高倍鏡下各取5個視野內細胞計數，腦微血管內皮細胞純度=陽性細胞數/全部細胞數，求其平均值，檢測腦微血管內皮細胞純度。

1.2.2體外培養腦皮層微血管內皮細胞損傷模型的建立參考文獻［5-6］損傷模型的方法加以改良。將經2次傳代純化滿意的BM EC傳代種植于6孔細胞培養板中培養，待細胞融合長滿。將預先設計好的標準模板（其上劃有縱、橫平行線，間距均為4 m m）置于培養板底部，吸除培養液，PBS液輕柔洗滌2遍，無菌環境直視下使用20μl微量移液器，t i p頭嚴格按模板線條用力均勻地制成縱、橫劃痕損傷，劃痕寬度約1 m m。確保實驗所用的BM EC損傷范圍和程度一致。

1.2.3PD TC干預劃痕損傷后BM EC的實驗分組處理BM EC經傳代純化滿意后，傳代種植于6孔細胞培養板中，待細胞長滿融合后，隨機平均分成對照組、單純損傷組、損傷+抑制組進行實驗，重復3次。分組處理前先吸除培養板中的原培養液并用PBS液輕柔沖洗2遍。對照組加入含10μl PBS液、10%FBS的DM EM培養液3 m l；單純損傷組按1.2.2方法建立劃痕損傷模型，然后加入與對照組相同的培養液；損傷+抑制組同單純損傷組建立損傷模型，然后加入含PDTC 10μl、10%FBS的DM EM培養液3m l（PDTC的終濃度為20μm ol/L）。各組分別于處理后1、6、12、24及48 h 5個時間點進行實驗。

1.2.4免疫熒光細胞化學方法檢測磷酸化N F-κB P65蛋白的表達棄去培養液，用冷PBS洗2遍，固定液固定30 m i n，洗滌2遍，滴加免疫染色封閉液，室溫封閉1 h，吸去封閉液后滴加一抗（1∶100稀釋的兔抗鼠磷酸化的NF-κB p65單克隆抗體）濕化盒中4℃孵育過夜。洗滌2遍，加二抗（1∶100稀釋的FITC標記山羊抗兔IgG），37℃避光孵育1 h，洗滌2遍，激光共聚焦顯微鏡下觀察。陰性對照組用0.01 m ol/L PBS代替一抗。以細胞核及胞漿內出現綠色熒光為陽性細胞，細胞內無綠色熒光為陰性細胞。利用Lei ca Conf ocal圖像分析軟件對熒光結果進行圖像分析，得出各組陽性細胞不同熒光強度值，從而得出各組中不同時間點磷酸化NF-κB P65蛋白表達的程度。

1.2.5Annexi n V/PI apopt os i s ki t檢測凋亡及壞死收集細胞培養液到一離心管中，用0.25%不含EDTA胰酶消化細胞至細胞可以被移液管或槍頭輕輕吹打下來時，終止消化。將細胞吹打下來，細胞懸液移至上述收集細胞培養液的離心管內混勻，1 000 r/m i n離心5 m i n，棄上清液后冷PBS液洗滌細胞2次。用500μl Bi ndi ng Buf f er懸浮細胞，滴加5μl Annexi n V-FITC并輕輕混勻，于2～8℃避光條件下孵育15m i n。滴加5μl PI后輕輕混勻，于2～8℃避光條件下孵育5 m i n。1 h內用流式細胞儀檢測，激發波長為488 nm，每個樣本均獲取10 000個細胞進行分析。

1.2.6W es t ern bl ot檢測自噬標志性蛋白LC 3Ⅱ表達情況于各個時間點提取各組細胞蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，分裝，保存于-80℃冰箱中。等量蛋白樣品經SDS-PAGE電泳分離，電轉移至PVDF膜上。再用封閉液室溫下搖動封閉1h，一抗（抗LC3 1∶1 000）4℃過夜，二抗（辣根過氧化物酶標記羊抗兔1∶5 000）室溫1 h。以上步驟操作后均用TBST緩沖液洗膜（15 m i n×3次），ECL顯色，X光片曝光，X光自動洗片機洗片顯影。膠片掃描、拍照，采用Im age J軟件采集結果圖像，取檢測蛋白與內參灰度值的比值。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，計量資料用均數±標準差（±s）表示，不同處理組、不同時間點的組內比較用單因素方差分析，多重比較用LSD檢驗法或SNK檢驗法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1體外培養SD大鼠BM EC形態及鑒定

倒置顯微鏡下見分離的腦微血管段長短不等、形態各異，呈單支或多支狀（見附圖A）。經膠原酶消化后，微血管管壁不清，但壁上BM EC清晰可見。培養24 h后，見微血管片段大部分已貼壁，BM EC從貼壁的微血管段周圍爬出，細胞多呈短梭形或多角形，排列不規則，核淡，胞膜明顯。培養2～3 d，細胞分裂增殖形成散在細胞群落，呈旋渦狀生長。7～9 d細胞呈長梭形、多角形，融合成片，排列緊密，互不重疊，形成致密的單層細胞，呈典型的“鋪路石”征象。初種的傳代細胞呈明亮的圓球形，懸浮于培養液中，4 h后大部分貼壁，細胞呈扁平狀，24 h后胞體變大。隨培養時間延長，BM EC多呈三角形、長梭形，約7～9 d，BM EC增殖成單層片狀（見附圖B）。免疫細胞熒光染色后，鏡下所有的細胞核呈紅色熒光，含第Ⅷ因子相關抗原的細胞漿呈綠色熒光，標記為陽性細胞（見附圖C）。以隨機5個不同視野中陽性細胞數占總細胞數的比例為細胞的純度，本實驗所培養的BM EC純度約90%。將細胞培養至80%～90%匯合狀態時，便可進行劃痕（見附圖D）和藥物干預實驗。

附圖　腦微血管內皮細胞

2.2免疫熒光細胞化學方法檢測磷酸化N F-κB p65蛋白表達

損傷后1 h各組磷酸化NF-κB p65蛋白表達量兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）。隨損傷時間延長NF-κB表達量逐漸增加，以24 h時改變最顯著，單純損傷組從6 h始差異有統計學意義（P＜0.01），48 h與24 h比較變化不明顯。損傷+抑制組于加入NF-κB抑制劑PDTC后，24 h始增加，6 h始NF-κB蛋白的表達較單純損傷組有所減少，與單純損傷組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3凋亡及壞死情況

1 h單純損傷組與損傷+抑制組凋亡程度差異無統計學意義（P＞0.05），但與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。隨著損傷時間延長，損傷組細胞凋亡程度相應增大。自6 h始單純損傷組與損傷+抑制組比較，兩者差異有統計學意義（P＜0.05）。單純損傷組的凋亡程度總體大于損傷+抑制組，凋亡的峰值出現在24 h（見表2）。對照組在細胞正常代謝狀態下壞死不明顯，與抑制組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。損傷后細胞壞死明顯，單純損傷組及損傷+抑制組細胞壞死程度自1 h始即與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01），而單純損傷組與損傷+抑制組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。隨損傷時間延長，損傷+抑制組壞死程度總體低于單純損傷組，自6 h始兩組間壞死程度差異有統計學意義（P＜0.05）。24 h壞死達高峰（見表3）。

表1　各組細胞不同時間點磷酸化N F-κB p65熒光值比較 （n=3，±s）

表1　各組細胞不同時間點磷酸化N F-κB p65熒光值比較 （n=3，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與單純損傷組比較，P＜0.05

組別4 8 h對照組　1 . 0 3 ± 0 . 0 6 　1 . 0 1 ± 0 . 0 3 　1 . 0 5 ± 0 . 0 5 　1 . 0 3 ± 0 . 0 6 　1 . 0 2 ± 0 . 0 5單純損傷組　1 . 5 2 ± 0 . 0 41）　2 . 6 4 ± 0 . 0 61）　3 . 6 4 ± 0 . 1 61）　6 . 0 2 ± 0 . 1 21）　6 . 0 3 ± 0 . 1 01）損傷+抑制組　1 . 5 2 ± 0 . 0 21）　1 . 5 3 ± 0 . 0 31）2）　1 . 5 2 ± 0 . 0 51）2）　4 . 4 5 ± 0 . 0 21）2）　3 . 6 2 ± 0 . 0 21）2）1 h 6 h 1 2 h 2 4 h

表2　各組細胞不同時間點凋亡百分率的比較 （n=3，±s）

表2　各組細胞不同時間點凋亡百分率的比較 （n=3，±s）

注：1）與單純損傷組比較，P＜0.05；2）與對照組比較，P＜0.05

組別4 8 h對照組　1 0 . 7 0 ± 0 . 1 71）　1 0 . 5 7 ± 0 . 7 11）　1 0 . 4 3 ± 0 . 7 01）　1 1 . 2 7 ± 1 . 1 01）　1 1 . 6 0 ± 0 . 5 31）單純損傷組　1 2 . 3 7 ± 0 . 3 52）　1 3 . 7 0 ± 0 . 4 02）　1 4 . 5 3 ± 0 . 6 52）　1 6 . 3 0 ± 0 . 5 62）　1 6 . 2 3 ± 0 . 5 72）損傷+抑制組　1 2 . 2 3 ± 0 . 3 12）　1 2 . 7 0 ± 0 . 4 01）2）　1 2 . 8 0 ± 1 . 1 11）2）　1 3 . 8 0 ± 0 . 3 61）2）　1 3 . 8 0 ± 0 . 8 11）2）1 h 6 h 1 2 h 2 4 h

2.4自噬情況

在1 h，單純損傷組、損傷+抑制組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05），但與對照組比較差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。損傷后6 h始單純損傷組與損傷+抑制組比較差異均有統計學意義（P＜0.01），24 h達高峰。見表4。

表3　各組細胞不同時間點壞死情況比較 （n=3，±s）

表3　各組細胞不同時間點壞死情況比較 （n=3，±s）

注：1）與單純損傷組比較，P＜0.05；2）與對照組比較，P＜0.05

組別4 8 h對照組　1 . 5 0 ± 0 . 2 01）　1 . 4 7 ± 0 . 3 11）　1 . 5 3 ± 0 . 5 6 　1 . 5 6 ± 0 . 3 51）　1 . 6 0 ± 0 . 5 31）單純損傷組　1 2 . 3 0 ± 0 . 3 02）　1 3 . 8 0 ± 0 . 4 02）　1 4 . 6 3 ± 0 . 6 52）　1 6 . 3 0 ± 0 . 4 62）　1 6 . 2 7 ± 0 . 5 12）損傷+抑制組　1 2 . 2 3 ± 0 . 3 82）　1 2 . 8 0 ± 0 . 4 01）2）　1 2 . 7 7 ± 1 . 1 21）2）　1 3 . 8 0 ± 0 . 2 61）2）　1 3 . 8 3 ± 0 . 1 51）2）1 h 6 h 1 2 h 2 4 h

表4　各組細胞不同時間點LC 3 I I表達與內參蛋白表達比值 （n=3，±s）

表4　各組細胞不同時間點LC 3 I I表達與內參蛋白表達比值 （n=3，±s）

注：1）與單純損傷組比較，P＜0.05；2）與對照組比較，P＜0.05

組別4 8 h對照組　0 . 1 4 ± 0 . 0 21）　0 . 1 6 ± 0 . 0 11）　0 . 1 7 ± 0 . 0 1 　0 . 1 9 ± 0 . 0 11）　0 . 2 0 ± 0 . 0 11）單純損傷組　0 . 2 4 ± 0 . 0 22）　0 . 5 5 ± 0 . 0 22）　0 . 7 7 ± 0 . 0 92）　1 . 2 1 ± 0 . 0 42）　1 . 1 8 ± 0 . 0 42）損傷+抑制組　0 . 2 5 ± 0 . 0 32）　0 . 2 5 ± 0 . 0 21）2）　0 . 2 6 ± 0 . 0 3 　0 . 4 4 ± 0 . 0 31）2）　0 . 4 4 ± 0 . 0 31）2）1 h 6 h 1 2 h 2 4 h

3　討論

既往忽視了BM EC在中樞神經系統中的重要作用，隨著“血管神經單元（neurovascul ar uni t）”概念的提出并對腦血管疾病的深入研究，逐漸認識到神經元、膠質細胞與BM EC的伙伴關系，BM EC可以膠質細胞為橋梁與神經元進行信息交流，發揮著重要作用。對創傷性腦損傷后早期BM EC的超微結構觀察可見線粒體等超微結構發生一系列病理改變，甚至部分血管可見內皮斷裂，內皮細胞消失［7-8］。應用中藥通絡救腦注射液作用于BM EC后收集到的條件培養液中神經元的生存活性明顯提高［10］。所以BM EC在腦損傷后的生存和死亡將直接影響到神經細胞的生存。

NF-κB以非活化形式廣泛存在于靜止期細胞的胞質中，多以蛋白二聚體與其特異性抑制蛋白IκB（i nhi bi t or κB，IκB）形成三聚體。當細胞受到刺激，IκB發生磷酸化而失活，暴露出活性的p50-p65；或因p105的C-端磷酸化降解從而形成活性的p50-p65復合體。p50-p65轉移到細胞核并與目標基因增強子的GGGRNNYY-CL序列結合，從而啟動或調節早期反應基因的轉錄，參與炎癥反應、細胞增殖和細胞凋亡等［10-14］。而抗氧化劑PDTC可特異性阻斷NF-κB的傳導通路［15］。細胞的繼發性死亡形式有3種：包括自噬、凋亡和壞死。腦損傷后NF-κB信號轉導通路對BM EC繼發性死亡的影響逐漸成為研究熱點。

實驗結果表明，損傷后BM EC內的NF-κB被激活，具有活性的磷酸化NF-κB p65蛋白表達量隨著損傷時間的延長而逐漸增加，損傷后12 h至24 h增加較快，于24 h達峰值，但48 h與24 h比較變化不明顯。而且損傷后體外培養的 BM EC內NF-κB表達有一定的時間依賴性，與在體顱腦損傷后NF-κB的表達水平［16］基本一致。與此同時，損傷后BM EC的自噬、凋亡及壞死的相關指標也有不同程度的增加。而在損傷后加入NF-κB抑制劑PDTC后，磷酸化NF-κB p65蛋白表達量較單純損傷組有所減少；相應地，BM EC的自噬、凋亡及壞死的相關指標也較單純損傷組有不同程度的減少。推測劃痕損傷可能通過激活NF-κB表達進而引發下游反應，從而引起BM ECs的自噬、凋亡及壞死。劃痕損傷后1 h至12 h自噬和凋亡指標明顯增加，而壞死于12 h后明顯增加，于24 h各項指標幾乎達到峰值。推測，激活NF-κB通路后，早期BM EC以凋亡和自噬這種自我保護形式為主，至晚期細胞炎癥因子大量表達，或凋亡、自噬過分表達，則以壞死為主。提示合理使用NF-κB抑制藥物（如PDTC）可以有效緩解腦損傷后BM EC各種死亡的程度，保持血腦屏障的完整性，穩定腦組織內環境，從而改善顱腦損傷的預后。與此同時，應用PDTC抑制NF-κB信號通路后，BM EC的凋亡、自噬及壞死進程并未被徹底阻斷，可能是PDTC不能完全阻斷NF-κB信號通路的活化，亦不能完全排除NF-κB通路通過其他機制參與BM EC死亡而不能被PDTC所抑制的情況。凋亡、自噬及壞死是多通路、多環節、緊密聯系并互相影響的復雜體系［17-19］，關于調節BM EC凋亡、自噬和壞死的更深一步機制以及細胞信號通路之間的交叉作用需要進一步深入研究。

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（申海菊編輯）

Effects of scratching damage on NF-κB expression in brain microvascular endothelial cells and secondary death of rats*

Zi-xiong Huang，Bing Chen，Li-rong Nie，Heng Lin，Wei Mo，Yan-qing Yin，Yuan-sheng Liang
（The Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang，Guangdong 524001，China）

Objective To culture brain microvascular endothelial cells（BMECs）of SD ratsin vitroand construct a model of scratching injury，so as to observe the effect of scratching injury on NF-κB expression as well as autophagy，apoptosis and necrosis of of BMECs.Methods BMECs of SD rats were culturedin vitroand scratching injury was implemented，then the cells were treated with pyrrolidine dithiocarbamate（PDTC），an NF-κB inhibitor.The cells were randomly devided into control group，simple-injury group and injury-inhibition group.At 1，6，12，24 and 48 hours after injury，NF-κB p65 expression was measured using immunofluorescent cytochemistry assay，apoptosis and necrosis of the cells were determined by Annexin V/PI staining，and expression of autophagy-related protein LC3 II was determined by Western blot.An uninjured group of BMECs was set as control.Results After scratching injury，NF-κB expression of the BMECs was enhanced from 1 h after injury，and peaked at 24 h，significantly higher than that of the control group（P＜0.05）.Indicators for apoptosis，necrosis and autophagy all increased to different extents as time went on，and they showed significant differences from those of the control group（P＜0.05）；while PDTC treatment following injury significantly inhibited these changes（P＜0.05）.Conclusions Scratching damage activates NF-κB expression of BMECs and causes autophagy，apoptosis and necrosis of BMECs.

scratching damage；BMEC；NF-κB；PDTC

R 651.15

A

1005-8982（2016）05-0011-06

10.3969/j.i s s n.1005-8982.2016.05.003

2015-10-21
*

2012年廣東醫學院附屬醫院青年科研基金（No：Qk1308）；2013年廣東醫學院青年科研基金（No：XQ1315）；2014年度湛江市非資助科技攻關計劃項目（No：湛科［2014］27號2014B101）

陳兵，E-m ai l：ChenBabee0@yeah.net