表皮生長因子受體和多藥耐藥蛋白在非小細胞肺癌中的表達及其與化學藥物治療療效的相關性

王曉敏，任力，岳穎，鄭吉春

（1.濰坊醫學院附屬醫院 病理科，山東 濰坊 261000；2.中國人民解放軍空軍總醫院 病理科，北京 100142）

表皮生長因子受體和多藥耐藥蛋白在非小細胞肺癌中的表達及其與化學藥物治療療效的相關性

王曉敏1，任力2，岳穎2，鄭吉春2

（1.濰坊醫學院附屬醫院 病理科，山東 濰坊 261000；2.中國人民解放軍空軍總醫院 病理科，北京 100142）

目的探討表皮生長因子受體（EG FR）與多藥耐藥蛋白（M D R）在非小細胞肺癌中的表達及與化學藥物治療（以下簡稱化療）療效的相關性。方法采用免疫組織化學二步法檢測95例非小細胞肺癌（N SC LC）組織和15例正常肺組織中EG FR與肺耐藥蛋白（LR P）、P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關蛋白（M R P）及谷光甘肽轉移酶（G ST-π）的表達。結果95例N SC LC中，EG FR、LR P、P-gp、M R P及G ST-π在N SC LC組織中的陽性表達率分別為50.53%、60.00%、40.00%、41.05%和55.79%。EG FR表達在有無吸煙史、不同病理類型（鱗癌vs腺癌）、不同TN M分期及有無淋巴結轉移的N SC LC患者間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。LR P和M R P在腺癌中的陽性表達率高于鱗癌（P＜0.05），M R P在高分化癌的表達陽性率低于中、低分化（P＜0.05）。M R P與LR P、P-gp與G ST-π的表達呈正相關（r=0.341，P=0.001；r=0.213，P=0.038），EG FR與LR P、P-gp、M R P、G ST-π的表達無關（P＞0.05）。EG FR陽性表達的化療有效率為37.5%，低于EG FR陰性表達的化療有效率（66.0%）（P＜0.05）。結論N SC LC組織中EG FR與多藥耐藥蛋白常陽性表達，形成M D R的4種蛋白相互聯系，可能對耐藥的形成起協同作用，EG FR可以作為評價N SC LC化療療效的客觀指標。

非小細胞肺癌；免疫組織化學；表皮生長因子受體；多藥耐藥蛋白

非小細胞肺癌（non-sm al l cel l l ung cancer，NSCLC）占肺癌的85%，是常見的惡性腫瘤之一，發病率、死亡率逐年上升。化學藥物治療（以下簡稱化療）是中晚期肺癌綜合治療的主要手段之一，然而多藥耐藥（m ul t i drug resi st ance，M DR）的產生明顯降低化療效果，是化療失敗的主要因素。M DR是一個復雜多變的過程，由多因素通過多途徑來實現，較常見的多藥耐藥因素包括：肺耐藥蛋白（l ung resi st ance prot ei n，LRP）、P-糖蛋白（P-gl ycoprot ei n，P-gp）、多藥耐藥相關蛋白（m ul t i-drug resi st ance associ at ed prot ei n，M RP） 和谷光甘肽轉移酶（gl ut at hi one S-t ransf erase-π，GST-π）等。表皮生長因子受體（epi derm al growt h f act or recept or，EGFR）是細胞增殖和信號傳導的受體，異常活化的EGFR與配體結合，調節腫瘤細胞的增殖、分化、放化療敏感性、抗凋亡等。本實驗通過免疫組織化學（EnVi si on）法檢測95例NSCLC組織和15例正常肺組織中EGFR、LRP、P-gp、M RP及GST-π的表達，研究其相互作用及與化療療效的相關性，初步探討NSCLC多藥耐藥的發生機制。

1　資料與方法

1.1一般資料

收集空軍總醫院2009年10月-2012年3月纖維支氣管鏡活檢或外科手術切除的NSCLC組織標本95例。其中，男性71例，女性24例；年齡26～80歲，平均（62±1）歲，有吸煙史的患者36例；鱗癌35例，腺癌60例；低分化癌27例，中、高分化癌68例；正電子發射計算機斷層顯像（posi t ron em i ssi oncom put ed t om ography，PET-CT）檢查：縱隔淋巴結轉移53例，無轉移42例；按照國際抗癌聯盟（Uni on Int ernat i onal Agai nst Cancer，UICC）2009年肺癌分期標準分期，Ⅰ、Ⅱ期40例，Ⅲ、Ⅳ55例。所有活檢或手術患者實驗前未接受任何抗腫瘤治療，實驗過程中接受＞3個療程含鉑化療方案，根據世界衛生組織標準判定療效，達完全緩解或部分緩解為有效，穩定或進展為無效。取遠離腫瘤的正常肺組織15例為對照組。EGFR鼠抗人單克隆抗體、LRP鼠抗人單克隆抗體、M RP鼠抗人單克隆抗體、P-gp鼠抗人單克隆抗體及GST-π鼠抗人單克隆抗體購自北京中杉生物科技有限公司。

1.2方法

經10%甲醛固定的NSCLC組織制備成蠟塊，4μm常規切片，置于特制的防脫載玻片上，En Vi si on法檢測腫瘤組織中EGFR、LRP、P-gp、M RP及GST-π表達。60℃烘干1 h，常規脫蠟、水化組織切片。經檸檬酸修復液修復抗原后切片，水洗、蒸餾水沖洗各1次，2 m i n/次，磷酸鹽緩沖溶液（phosphat e buf f er sal i ne，PBS）沖洗3次，2 m i n/次；放入3%過氧化氫溶液中10 m i n，以滅活內源性過氧化氫酶，水洗、蒸餾水洗各2 m i n；滴加第一抗體，置于濕盒內，恒溫箱37℃孵育45 m i n后水洗、蒸餾水沖洗各1次，2 m i n/次，PBS液沖洗3次，2 m i n/次；En Vi si onTM孵育30 m i n，水洗、蒸餾水洗各2 m i n，PBS沖洗片3次，3 m i n/次。二氨基聯苯胺（Di am i nobenzi di ne，DAB）顯色3～5 m i n，蘇木素對比復染，中性樹脂封固。以同一條件下染色的陽性顆粒作陽性對照組，用PBS代替一抗作陰性對照組。

1.3結果判讀

陽性為細胞出現棕黃色顆粒，陰性為無顯色。EGFR、M RP陽性著色在細胞膜和/或細胞漿，P-gp陽性著色在細胞膜，LRP陽性著色在細胞漿，GST-π著色在細胞核和/或細胞漿。根據其染色程度及細胞數量進行染色評分判讀，陽性細胞評分法：陰性為0分，陽性細胞比例＜25%為1分，陽性細胞比例25%～50% 為2分，陽性細胞比例51%～75%為3分，陽性細胞比例＞75%為4分。細胞染色程度評分法：腫瘤細胞不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。上述兩項之和即為腫瘤細胞的染色評分，總分0分為陰性（-），1、2分為弱陽性（+），3～6分為陽性（++），7～12分為強陽性（+++）［1］。

1.4統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，用χ2檢驗及Spearm an秩和相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組EG FR、LR P、P-gp、M R P及G ST-π的表達

95例NSCLC患者中，EGFR、LRP、P-gp、M RP及GST-π在 NSCLC組織中的陽性表達率分別為50.53%（48/95）、60.00%（57/95）、40.00%（38/95）、41.05%（39/95）和55.79%（53/95），明顯高于正常肺組織 6.25%（1/15）、20.00%（3/15）、13.33%（2/15）、0.00（0/15）和13.33%（2/15）（P＜0.05）。見圖1～8和表1。

圖1　正常肺組織蘇木精-伊紅染色 （×200）

圖2　N SC LC蘇木精-伊紅染色 （×200）

圖3　N SC LC免疫組織化學染色陰性對照 （×200）

圖4　EG FR免疫組織化學染色表達于N SC LC的細胞漿和細胞膜 （×400）

圖5　P-gp免疫組織化學染色表達于N SC LC的細胞膜（×400）

圖6　M R P免疫組織化學染色表達于N SC LC的細胞膜和細胞漿 （×400）

圖7　G ST-π免疫組織化學染色表達于N SC LC的細胞漿和細胞核 （×400）

圖8　LR P免疫組織化學染色表達于N SC LC的細胞漿（×400）

2.2EG FR、LR P、P-gp、M R P及G ST-π表達與臨床病理因素的相關性

EGFR陽性表達率比較，吸煙、腺癌和淋巴結轉移的患者高于未吸煙、鱗癌和無淋巴結轉移的患者（P＜0.05）；Ⅲ、Ⅳ期患者明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P＜0.05）；而EGFR陽性表達率與患者性別、年齡、腫瘤大小和腫瘤分化程度等無關。LRP和M RP在腺癌中的陽性表達率高于鱗癌（P＜0.05）。不同分化程度NSCLC患者的M RP表達比較，差異有統計學意義，高分化癌患者的陽性率低于中、低分化（P＜0.05）。女性患者的GST-π陽性表達率低于男性患者，而與患者年齡、是否吸煙、腫瘤病理類型、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移和腫瘤分化程度等無關。見表2。

表1　兩組患者EG FR、LR P、P-gp、M R P及G ST-π的表達比較　例

表2　臨床病理因素與EG FR、LR P、P-gp、M R P及G ST-π表達的相關性　例

2.3EG FR、LR P、P-gp、M R P及G ST-π表達在N SC LC腫瘤組織中的相關性

Spearm an秩和相關性分析顯示，NSCLC組織中EGFR與LRP、P-gp、M RP、GST-π的表達無關（P＞0.05）；M RP與LRP的表達呈正相關（r=0.341，P= 0.001），P-gp與GST-π的表達呈正相關（r=0.213，P= 0.038）。

2.4EG FR及多藥耐藥蛋白表達與N SC LC臨床化療療效的相關性

NSCLC患者均接受＞3個療程的含鉑化療方案，有效為率51.6%（49/95）。所有患者有完整的隨訪資料，生存期為接受化療之日起至患者死亡或失訪日。中位隨訪時間為33個月，其中死亡47例。EGFR陽性表達的化療有效率為37.5%（18/48），EGFR陰性表達的化療有效率為66.0%（31/47），經χ2檢驗，差異有統計學意義（P=0.006），EGFR過度表達的化療有效率低于EGFR陰性表達的化療有效率。在本研究中，P-gp陰性表達的化療有效率為52.6%，P-gp陽性表達的化療有效率為50.0%，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P=0.801）；LRP、M RP及GST-π陽性表達患者的化療有效率低于3者均陰性的患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3　EG FR、LR P、P-gp、M R P及G ST-π表達與N SC LC臨床化療療效的相關性

3　討論

NSCLC化療失敗的重要原因是腫瘤對藥物產生多藥耐藥，其產生與多種因素有關，包括多藥耐藥基因及編碼的糖蛋白、M RP、LRP、GST-π、細胞凋亡抑制、DNA損傷修復功能等，可見腫瘤的多藥耐藥機制很復雜，是多因素共同參與的過程。EGFR參與調節腫瘤細胞的增殖、分化、抗放化療、抗凋亡等，與NSCLC化療療效及預后密切相關。

EGFR是上皮生長因子細胞增殖和信號傳導的受體，一旦被激活，可使腫瘤細胞內發生酪氨酸蛋白激酶活化和受體自身磷酸化，促進腫瘤的發生、發展和轉移。EGFR在肺癌中的分布和表達已經明確，許多學者用免疫組織化學法對EGFR在肺癌中的分布和表達進行研究并證實，在正常肺組織中EGFR僅表達5%～10%；在肺癌中，小細胞肺癌無EGFR陽性表達，NSCLC陽性表達的發生率為53.1%～69.7%［2-3］。本研究NSCLC腫瘤組織中EGFR陽性表達率為50.53%，明顯高于對照組的陽性表達率。王瑞娟等［4］發現，EGFR在NSCLC中的陽性表達率為64.4%，癌旁組織未見表達，與TNM分期及淋巴結轉移相關。Sel vaggi等［5］研究發現，NSCLC中EGFR的陽性表達率在Ⅲ期肺癌中最高，與其組織類型無關。本研究中Ⅲ、Ⅳ期NSCLC患者的EGFR陽性表達高于Ⅰ、Ⅱ期患者，有淋巴結轉移的EGFR表達高于無淋巴結轉移，進一步提示EGFR參與NSCLC的發生、發展及轉移。EGFR在調節正常細胞的生長和分化中起重要作用，而其在包括NSCLC在內的許多腫瘤組織中過度表達，與預后不良、生存期縮短及存在耐藥性相關。研究發現，在NSCLC患者中，特異性EGFR單克隆抗體與鉑類聯合應用較單用鉑類化療的有效率從29%升高到53%。對鉑類產生耐藥的NSCLC應用特異性EGFR單克隆抗體后，部分患者對鉑類的敏感性得以恢復，EGFR過表達能影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［6］。本研究結果進一步證實，EGFR過表達的NSCLC化療療效明顯降低，部分患者雖然EGFR陰性，但是化療效果不佳，說明EGFR與腫瘤及化療藥物的耐藥性存在一定聯系，而腫瘤的耐藥是多種耐藥因素參與，以及不同耐藥機制共同影響的結果。

M DR是指使用抗腫瘤藥物及未用藥物治療的惡性腫瘤，通過不同作用機制對不同化療藥物產生耐藥性，包括原發性和獲得性，目前對肺癌多藥耐藥研究比較成熟的有 LRP、P-gp、M RP、GST-π 及TopoⅡ等。LRP是最先在肺癌中發現的耐藥蛋白，是一種非耗能型轉運蛋白。研究證實，LRP將化療藥物儲存入胞質囊泡，使藥物很難進入細胞核發揮作用，并以胞吐的形式將藥物從細胞中排出，從而產生耐藥［7］。M RP是谷胱甘肽共軛物轉運泵，與谷胱甘肽共同作用起藥物泵作用，還可以通過改變細胞內pH值來改變細胞內藥物分布，并逆濃度梯度降低細胞內藥物濃度，最終達到耐藥的目的［8］。在本研究中，95 例NSCLC患者腫瘤組織的EGFR、LRP、P-gp、M RP 及GST-π陽性表達率明顯高于正常肺組織，差異有統計學意義，與國內大量文獻報道基本一致［9-12］。LRP 與M RP在不同類型肺癌中的表達不同。本研究發現，95例NSCLC患者中，LRP與M RP在腺癌中的陽性表達率高于鱗癌（P＜0.05），與臨床上腺癌對化療更易存在耐藥性，鱗癌相對對化療更敏感相符。此外，不同分化程度的NSCLC患者的M RP表達比較，差異有統計學意義，高分化癌的陽性率低于中、低分化（P＜0.05），該現象未見報道。P-gp是多藥耐藥基因M DR1編碼的膜糖蛋白，是一種耗能型藥物泵，能將進入細胞的親脂性化療藥物泵出細胞外，從而降低化療藥的療效［13］。GST有3種同工酶，分別是GST-α、GST-μ和GST-π，其中GST-π是腫瘤細胞中最常見的耐藥蛋白，既能提高細胞的解毒、抗氧化能力從而降低惡性腫瘤發生的幾率，又能增強腫瘤細胞對化療藥物的代謝及轉運能力，使細胞產生耐藥［14］。本研究中，腺癌與鱗癌的P-gp、GST-π表達比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究還發現，M RP與LRP的表達呈正相關（r=0.341，P=0.001），P-gp與GST-π的表達呈正相關（r=0.213，P=0.038），說明參與形成M DR的4種蛋白并非獨立因素，而是相互聯系，可能對多藥耐藥的形成起協同作用，與一些研究結果大致相同［15］。

在本研究中，95例NSCLC患者腫瘤組織的EGFR、LRP、P-gp、M RP及GST-π陽性表達率分別為50.53%（48/95）、60.00%（57/95）、40.00%（38/95）、41.05%（39/95）和55.79%（53/95），提示EGFR及4種多藥耐藥蛋白在NSCLC中過度表達，導致腫瘤的耐藥。EGFR與4種多藥耐藥蛋白在NSCLC中的表達無相關，EGFR蛋白過度表達的化療有效率為37.5%（18/48）明顯低于EGFR陰性的有效率66.0% （31/47），差異有統計學意義，部分患者雖然EGFR陰性，但是化療效果不佳；LRP、P-gp、M RP及GST-π一種或多種表達的患者化療有效率低于4者均陰性的患者，由此可見，多藥耐藥蛋白是抗腫瘤失敗的重要原因之一。以上表明影響腫瘤耐藥機制的多因素性，說明EGFR可以作為評價NSCLC化療療效的獨立指標，而且EGFR與多藥耐藥蛋白分別是導致腫瘤耐藥形成的獨立因素，因此聯合檢測多個耐藥相關抗體，能夠客觀反映腫瘤的耐藥，預測腫瘤化療療效及預后，為臨床制定聯合化療方案，提高療效提供依據。

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（申海菊編輯）

Expressions of EGFR and MRPs in NSCLC and their correlations with effect of chemotherapy

Xiao-min Wang1，Li Ren2，Ying Yue2，Ji-chun Zheng2
（1.Department of Pathology，the Affiliated Hospital of Weifang Medical University，Weifang，Shandong 261000，China；2.Department of Pathology，General Hospital of PLA Air Force，Beijing 100142，China）

Objective To investigate the expressions of epidermal growth factor receptor（EGFR）and multidrug resistance-associated protein（MRP），and their relationships with efficacy of chemotherapy in non-small cell lung cancer（NSCLC）.Methods Immunohistochemistry（EnVision method）was used to detect the expressions of EGFR，lung resistance protein（LRP），P-glycoprotein（P-gp），MRP and glutathione S-transferase π （GST-π）in NSCLC tissues of 95 patients and 15 normal lung samples.Results The positive-expression rates of EGFR，LRP，P-gp，MRP and GST-π in the NSCLC were 50.53%，60.00%，40.00%，41.05%and 55.79% respectively.EGFR in the NSCLC tissues was significantly correlated with the history of smoking，pathological types of cancer（squamous cell carcinoma vs adenocarcinoma），presence of lymph node metastasis and TNM stages（P＜0.05）.The positive-expression rates of LRP and MRP in the adenocarcinomas were higher than those in the squamous cell carcinomas（P＜0.05），and the expression rate of MRP in the well-differentiated carcinomas was higher than that in the medium-and poorly-differentiated carcinomas（P＜0.05）.There were positive correlations between the expressions of MRP and LRP，P-gp and GST-π in the NSCLC（r=0.341，P=0.001；r=0.213，P=0.038）.EGFR had no correlation with LRP，P-gp，MRP or GST-π（P＞0.05）.The chemotherapy efficiency for the EGFR-negative NSCLC was 66.0%，which was significantly higher than that for the EGFR-positive NSCLC（37.5%，P＜0.05）.Conclusions EGFR and MRP are over-expressed in NSCLC tissues. Multidrug resistance proteins have synergistic effects on drug resistance.EGFR could be used to objectively predict chemotherapy effect and prognosis of NSCLC.

non-small cell lung cancer；immunohistochemistry；epidermal growth factor receptor；multidrug resistance protein

R 734.2

A

1005-8982（2016）05-0053-06

10.3969/j.i s s n.1005-8982.2016.05.011

2013-09-18