過表達一個疣粒野生稻的Ricin_B 凝集素基因OmR40c1增強水稻耐鹽性

陳賢　董巖　周潔　王栩鳴　嚴成其, *　陳劍平, *

(1浙江大學 農業與生物技術學院， 杭州 310029； 2浙江省農業科學院 病毒與生物技術研究所， 杭州 310021； 3南京農業大學 植物保護學院， 南京 210095 ； *通訊聯系人， E-mail: jpchen2001@126.com, yanchengqi@163.com)

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過表達一個疣粒野生稻的Ricin_B 凝集素基因OmR40c1增強水稻耐鹽性

陳賢1, 2董巖2, 3周潔2王栩鳴2嚴成其2, *陳劍平1, 2, *

(1浙江大學 農業與生物技術學院， 杭州 310029；2浙江省農業科學院 病毒與生物技術研究所， 杭州 310021；3南京農業大學 植物保護學院， 南京 210095 ；*通訊聯系人， E-mail: jpchen2001@126.com, yanchengqi@163.com)

CHEN Xian, DONG Yan, ZHOU Ji, et al. Over-expression ofOmR40c1, a ricin_B lectin fromOryzameyerianaL. enhances salt tolerance in transgenic pants. Chin J Rice Sci, 2016, 30(4): 335-344.

陳賢, 董巖, 周潔, 等. 過表達一個疣粒野生稻的Ricin_B 凝集素基因OmR40c1增強水稻耐鹽性. 中國水稻科學， 2016， 30(4)： 335-344.

摘要:鹽脅迫是影響鹽/堿稻區水稻產量的主要逆境因素。研究耐鹽相關基因，對于培育水稻抗逆品種具有重要意義。OmR40c1是從疣粒野生稻(Oryza meyeriana)中分離獲得cDNA序列，與已報道的受脫落酸與鹽誘導的OsR40c1的CDS序列完全相同，但在5′端UTR和3′端UTR區域有差別。有關OmR40c1基因功能的研究還未見報道。本研究的主要目的是初步分析OmR40c1在水稻耐鹽性中的作用。對栽培稻日本晴(Oryza sativa L. var. Nipponbare)進行脫落酸(abscisic acid，ABA)和鹽脅迫處理，OsR40c1基因均上調表達。構建基因定位載體并注射煙草表皮細胞，其結果表明OmR40c1定位于細胞質膜和細胞核上。構建超表達載體并轉染日本晴，PCR及qRT-PCR結果均顯示OmR40c1在轉基因材料中成功表達。OmR40c1可能參與種子萌發。174 mmol/L鹽脅迫下，野生型種子的發芽率下調一半左右，轉OmR40c1基因水稻種子發芽未受影響；轉OmR40c1水稻苗期的株高是未經鹽處理轉基因水稻株高的一半左右；而野生型的株高是未經鹽處理野生型水稻株高的1/6左右。鹽脅迫下，水稻葉片、根長等都受到不同程度的影響。鹽脅迫下，轉OmR40c1基因水稻植株內的Na+濃度是野生型的1.38倍； K+濃度是野生型的1.25倍。綜上，OmR40c1一定程度提高了水稻的耐鹽性，且苗期的耐鹽性高于成株期。

關鍵詞:疣粒野生稻； OmR40c1； 轉基因； 耐鹽性

水稻是我國主要的糧食作物之一，鹽脅迫是影響鹽/堿稻區水稻產量的主要逆境因素[1]。我國鹽/堿稻區占水稻栽培總面積的20%左右，其面積在逐年擴大，嚴重威脅糧食安全[2]。鹽脅迫對植物的傷害主要包括脫水、離子毒害和營養缺乏[3]。水稻受鹽脅迫后在發育和形態上主要表現為發芽率降低[4]、分蘗數減少[5]、產量和品質下降[6]。培育耐鹽/堿水稻品種是發展鹽/堿稻區水稻生產最為經濟有效的途徑之一[7]，而挖掘和利用鹽/堿新基因則是培育耐鹽/堿水稻品種的核心和基礎。

鹽脅迫機制和植物耐鹽適應性的分子機理十分復雜。鹽脅迫會造成植物葉片中的葉綠素含量降低[8]、光合作用減弱[9]、誘導活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)合成[10]、細胞膜受損[11]、Ca2+及K+外滲[12]和Na+大量積累[9]等。水稻則通過液泡[13]、可溶性小分子有機物[14]及無機鹽離子調控細胞滲透壓[15]，通過抗氧化物酶清除活性氧維持細胞膜的完整性來增強耐鹽性[16]。OsMSR2是一個水稻類鈣調節蛋白，它可能通過ABA信號途徑增強擬南芥的耐鹽性[17]。親環素蛋白OsCYP2可通過離子再平衡和削弱ROS的積累來增強煙草的耐鹽性[18]。OsMyB2是一個水稻轉錄因子，它可通過正調控抗氧化酶的活性和增加脯氨酸的積累及促進可溶性糖的合成來提高水稻的耐鹽性[19]。

水稻中有許多受到鹽脅迫誘導表達的基因，也可被ABA誘導表達，暗示ABA信號途徑在參與調控水稻應對鹽脅迫中有著重要的作用[20]。OsR40c1是一個受ABA和鹽脅迫誘導表達的栽培稻的Ricin_B蛋白[21]。本研究從疣粒野生稻中獲得的OmR40c1的CDS序列與已報道的OsR40c1完全相同，僅在UTR區域有差異。而有關OmR40c1耐鹽性的研究還未見報道。本研究通過對轉OmR40c1基因水稻T1代種子鹽脅迫下發芽率、株高、苗期的鮮質量及干質量、Na+及K+離子含量等耐鹽相關指標的分析，以期為進一步研究OmR40c1參與水稻的抗逆提供新的依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1植物材料與菌株

疣粒野生稻(OryzameyerianaNees et Arn. ex Hook. e.)由云南省農業科學院陶大云教授和中國水稻研究所魏興華研究員提供，大量用疣粒野生稻由浙江省農業科學院病毒學與生物技術研究所繁育和保存。栽培稻日本晴種子(OryzasativaL. var. Nipponbare)由本實驗室繁育和保存。大腸桿菌DH5α (EscheriachiacoliDH5α)和根癌農桿菌EHA105 (Agrobacteriumtumefaciens， EHA105)以及ccdBr2菌株均由本實驗室保存。本氏煙草(Nicotianabenthamiana, NB)、日本晴和疣粒野生稻均種植于浙江省農業科學院病毒學與生物技術研究所智能陽光溫室。

1.1.2質粒載體與試劑

克隆載體pJET 1.2購自于賽默飛世爾科技(中國)有限公司(Thermo Fisher Scientific)，pMD19T購自TaKaRa公司，pX2E-T、pCAMBIA-1300UR-DEST、pGWB505及 pGWB506質粒購自Invitrogen公司。Pyrobest DNA聚合酶和rTaqDNA聚合酶均購自TaKaRa公司，phsuion 高保真 DNA聚合酶購自NEB公司，TRIzol購自上海普飛生物公司，無核糖核酸酶水購自QIAGEN公司，三氯甲烷購自南京化學試劑有限公司，異丙醇購自AMRESCO公司，無水乙醇購自MREDA公司，第一鏈cDNA合成試劑盒購自Bio-Rad公司，第一鏈cDNA合成試劑盒購自NEB公司，反轉錄cDNA第一鏈合成試劑盒購自Clontech公司，實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green Real time PCR Master Mix)購自TOYOBO公司，DNA 連接試劑盒購自TaKaRa公司。其他試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1OsR40c1的誘導表達特征分析

為了研究OsR40c1對激素及環境因子脅迫的響應，我們利用0.1 mol/L ABA和100 mmol/L NaCl對長勢一致的野生型日本晴小苗(3葉期)根部處理6 h和24 h，每組3株幼苗。利用TRIzol法[22]提取葉片總RNA，逆轉錄成cDNA后，以OsActin為內參基因，采用相對定量法檢測分析OmR40c1的表達量。OsActin: F_5′GAGTATGA

TGAGTCGGGTCCAG3′，R_5′ACACCAACAATC

CCAAACAGAG3′；OsR40c1：F_5′CAAGGACGA

GGAAGGCTA3′， R_5′_CGAAGTTGAGGTAGA

1.2.2Gateway體系入門載體的構建

根據RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)中公布的OmR40c1(Os03g21040.2)的核苷酸序列，設計基因全長引物：F_5′ ATGTTCGGCTTCGGGCACCAC3′和R_5′GCTTACC AGGGGACGATCTTCCA3′。利用本實驗室保存的PJET-OmR40c1為模板，在KOD-FX高保真聚合酶作用下進行PCR擴增，具體PCR流程如下： 94℃下2 min；94℃下30 s, 58℃下30 s，68℃下90 s，共35個循環；68℃下8 min。PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后回收并純化得到OmR40c1片段。并在T4連接酶的幫助下將其連接到PX2E-T入門載體中[23]，然后熱擊轉化到DH5α中[24]，具體步驟如下：從-70℃冰箱中取出感受態細胞放在冰上融化10 min，加入10 μL連接產物后冰上放置30 min；42℃下熱擊90 s后立即冰上靜置2 min；接著添加500 μL的SOC培養基，并在振蕩搖床中培養1 h (37℃，225 r/min)；吸取60 μL菌液涂于含有100 mg/L氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)的LB固體培養基上，37℃下倒置培養過夜。從平板上挑取單克隆，并接種于含有100 mg/L Amp的LB液體培養基中，震蕩培養過夜(37℃，225 r/min)。菌液PCR陽性檢測后送至博尚生物測序公司進行序列檢測。

1.2.3OmR40c1亞細胞定位載體的構建

以OmR40c1-PX2E-T為入門載體，分別與目的表達載體pGWB505和pGWB506通過LR反應構建OmR40c1-pGWB505與OmR40c1-pGWB506[25]。將重組產物導入到DH5a感受態細胞中，菌液PCR陽性檢測后送至鉑尚生物公司測序。將測序正確的質粒OmR40c1-pGWB505與OmR40c1- pGWB506分別電擊到EHA105中，具體操作如下：從-70℃冰箱取出感受態細胞后置于冰上10 min，向管內添加2.5 μL質粒，混勻后冰上靜置30 min；將混合液轉移到已預冷的2 mm電擊杯中，2300 V 電擊轉化完后向管內添加 500 μL YEP液體培養基并輕微混勻。將杯內溶液轉移到另一無菌的離心管中，28℃、210 r/min下搖床、暗培養3 h；接著吸取60 μL菌液涂于含有50 mg/L大觀霉素(Spectinomycin, Spe)和50 mg/L鏈霉素(Straptomycin, Str)雙抗的YEP平板上，28℃下培養36 h。挑取單克隆于含有50 mg/L Spe和50 mg/L Str雙抗的YEP液體培養基中28℃下培養過夜后用基因特異引物檢測。挑取PCR陽性克隆并擴大培養，并于4000×g下離心5 min收集菌體；利用浸潤液[含10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES (pH 5.6)，200 μmol/L乙酰丁香酮(As)]重懸細胞，并將菌液濃度調至OD600=0.8～1.0。利用2 mL注射器在煙草葉片背面將菌液緩慢滲透注射到葉片組織間隙中，25℃下培養3 d。參照萊卡(Leica) 激光共聚焦顯微鏡使用手冊，在顯微鏡下觀察并拍照記錄細胞的定位情況。

1.2.4OmR40c1超表達載體的構建

將測序正確的PX2E-T-OmR40c1與P1300 pCAMBIA-1300UR-DEST進行重組反應[25]。將重組產物導入到DH5a細胞中，菌液PCR陽性檢測后送至測序。將測序正確的P1300UR-OmR40c1質粒電擊到EHA105，菌液檢測陽性的將作為下一步遺傳轉化菌株。

1.2.5根癌農桿菌介導的OmR40c1水稻遺傳轉化

利用農桿菌介導的水稻愈傷遺傳轉化技術將OmR40c1導入到水稻基因組中[26]，具體操作如下：將去殼的粳稻日本晴種子浸泡在含有70%無水乙醇中約2 min后，用20%次氯酸鈉消毒30 min，接著使用無菌水沖洗6次，最后浸泡在無菌水中約30 min。將種子轉移到粳稻誘導培養基中，置于28℃光照培養箱中誘導愈傷組織。14 d繼代1次，共2次。選取結實、圓潤、淺黃且長勢良好的小愈傷組織用于侵染。將帶有重組質粒的農桿菌接菌到YEP培養基中，28℃下振蕩培養20 h。吸取1 mL菌液，5000 r/min下離心5 min，棄上清；菌體重懸于AAM培養基中，將OD600調至0.05～0.15。將愈傷組織置于培養液中浸泡15 min，晾干后置于共培養基上，28℃下暗培養36 h。然后置于選擇培養基上；14 d選擇1次，共2次。將抗性愈傷置于分化培養基上，直至小苗頂蓋生長。向分化罐中添加少許超純水，煉苗一周后移栽至智能溫室的土槽中，獲得T0代株系，繁育得到T1代株系后進行下一步實驗。

1.2.6OmR40c1轉基因植株的DNA檢測

以堿性裂解法[27]快速提取的水稻基因組DNA為模板，具體步驟如下：剪取2 cm長的水稻葉片，液氮磨碎；向2 mL EP管內添加100 μL 0.1 mol/L NaOH，振蕩混勻；接著向管內添加100 μL 0.1 mol/L Tris-HCl(pH=8.0)，離心取上清進行PCR。依據潮霉素序列設計引物(Hyg: F_5′CGTCTGC TGCTCCATACAA3′；Hyg: R_ 5′TCAATACACTACATGGCGTGA3′)進行PCR檢測。PCR程序程序如下：94℃下4 min；94℃下30 s，58℃下30 s，72℃下30 s，共35個循環；72℃下延伸8 min。通過PCR篩選出來的陽性株系進行進一步的RT-PCR驗證。

1.2.7OmR40c1在轉基因株系中的表達分析

利用TRIzol法提取轉基因小苗5葉期葉片中的總RNA，參照Bio-Rad公司逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。以OsActin為內參基因，采用相對定量法確定OsR40c1在轉錄中的表達量。引物及qRT-PCR體系參照步驟1.2.1。

1.2.8OmR40c1轉基因水稻的耐鹽性分析

將去殼消毒的OmR40c1T1代種子置于含174 mmol/L NaCl的1/2 MS(50 mg/L HyG)培養基上，并置于智能光照培養箱中(光照12 h，溫度30℃)培養10 d。野生型置于無抗的1/2 MS(174 mmol/L NaCl)中作為對照組。觀察野生型和轉基因水稻的成活率及其株高。每組實驗每個株系種子30粒，3個技術重復，生物學重復2次。

1.2.9OmR40c1轉基因水稻生理生化指標的測定

將去殼消毒的OmR40c1T1代種子置于1/2 MS(50 mg/L HyG)培養基上，野生型日本晴種子置于1/2 MS(174 mmol/L NaCl)中，然后置于智能光照培養箱中(光照12 h，溫度30℃)培養10 d。將小苗轉移到水稻水培營養液中繼續培養約3周。將轉基因和野生型水稻分成2組。一組在新鮮的水培營養液中繼續培養，另一組則在含有174 mmol/L NaCl的水培營養液中進行鹽脅迫處理。10 d后，分別記錄兩組水稻在鹽處理前后的鮮質量、綠葉數及根長。120℃下殺青30 min，然后90℃下烘干并分別記錄兩組水稻在鹽處理前后的恒重。每組實驗每個株系8株。

1.2.10OmR40c1轉基因水稻中Na+、K+離子濃度的測定

將烘干的水稻碾磨成粉末狀，按質量體積比(v/m)1∶16加入濃硫酸，消煮3h；接著轉移到容量瓶中定容。最后利用火焰分光光度計(FP6410，杭州匯爾)分別測量兩組水稻在鹽處理前后Na+、K+離子的含量。

圖1ABA和鹽脅迫OmR40c1的誘導表達量分析

Fig.1. Expression of OmR40c1in response to ABA and salt stress.

2結果與分析

2.1OsR40c1的誘導表達

以OsActin為內參，利用RT-PCR技術分析OsR40c1在ABA和NaCl脅迫下苗期日本晴葉片中的表達情況。如圖1所示，OsR40c1為一個誘導型表達基因，在處理0 h的葉片中幾乎不表達。ABA處理6 h和24 h，OsR40c1的表達量均上調；鹽脅迫6 h和24 h，OsR40c1的表達量也均上調。OsR40c1受ABA和鹽脅迫誘導表達，其表達特征與之前的研究結果[21]一致。

2.2表達載體P1300UR-OmR40c1的構建

為了加快載體構建的速度，我們采用了Invitrogen公司的Gataway載體構建系統，實現了目的基因在不同載體之間的快速平衡轉移，從而省去繁瑣的目的片段酶切、純化及連接過程。如圖2所示，從疣粒野生稻中獲得OmR40c1基因片段后，我們在這些基因片段的5′及3′端各加一個核苷酸A，然后通過T-A連接到入門載體pX2E-T中，獲得OmR40c1-pX2E-T入門載體。通過重組的方式將入門載體中目的片段轉移到表達載體p1300UR中，進而獲得表達載體p1300UR-OmR40c1。

2.3OmR40c1蛋白的亞細胞定位

通過LR反應將入門載體PX2E-T上的目的基因OmR40c1平行轉移到目的表達載體pGW505及pGW506中，進而獲得融合表達載體。接著將融合表達載體電擊到根癌農桿菌電擊感受態細胞EHA105中。注射煙草葉片下表皮48～72 h后，在共聚焦顯微鏡下觀察。如圖3所示，OmR40c1基因在GFP的N末端時，融合蛋白定位在細胞膜和細胞核上；OmR40c1基因在GFP的C末端時，融合蛋白也是定位在細胞膜和細胞核上。該結果表明OmR40c1蛋白定位在細胞膜和細胞核上。

A-OmR40c1入門載體構建； B-OmR40c1轉基因表達載體構建； C-OmR40c1表達載體擴增結果。M-分子量標記。

A, CDS ofOmR40c1in entry cloning T-vector pX2E-T; B, CDS ofOmR40c1betweenattR1 andattR2 in P1300UR-DEST analysis vector; C, Cloning ofOmR40c1gene coding sequence (CDS) by PCR. M-Marker.

圖2p1300UR-OmR40c1表達載體的構建及其菌液PCR

Fig. 2. Construction of recombinant plasmid of p1300UR-OmR40c1.

nGFP表示GFP蛋白N末端與目的蛋白C末端融合； cGFP表示GFP蛋白C末端與目的蛋白N末端融合。Bar = 10 μm。

NGFP, pGW505 (_505, 35S: GFP - Gene fusion); cGFP, pGW506 (_506, 35S: GFP- Gene fusion) vectors. Bar = 10 μm.

圖3OmR40c1蛋白在煙草葉片表皮細胞中的亞細胞定位

Fig. 3. Subcellular location of OmR40c1 protein in tobacco leaf cells.

2.4轉基因株系的DNA檢測

我們將獲得的OmR40c1片段連接到入門載體PX2E-T中，然后與目的載體P1300UR-DEST重組，最終獲得OmR40c1-P1300UR超表達載體。然后，通過電擊方式將其導入到EHA105感受態細胞中，并借助根癌農桿菌將目的基因OmR40c1整合到水稻愈傷細胞的基因組中，通過培養、篩選、分化、煉苗、水培及移栽等水稻轉基因步驟獲得了T0代植株。我們一共轉化4×31組OmR40c1愈傷組織，并獲得75株T0代轉基因小苗，其中10株為白化苗，另有49組未分化出小苗；PCR鑒定除白化苗后的48株小苗，共獲得14株陽性小苗(圖4)。

A-泳道1～12分別表示12株轉基因水稻； B-泳道1～8分別代表8株轉基因水稻，9～10代表野生型日本晴，11～12代表超純水。

A， Lanes 1-12 indicate transgenic rice plants; B, 1-8 indicate transgenic rice plants; 9-10 indicate wild type rice plants; 11-12 indicate water.

圖4 轉OmR40c1水稻的PCR鑒定結果

Fig. 4. PCR identification of OmR40c1 transgenic rice plants.

圖5qRT-PCR分析OmR40c1在轉基因水稻中的表達

Fig. 5. Real-time PCR analysis of OmR40c1 in transgenic rice plants.

2.5轉基因株系的RT-PCR檢測

分別提取OmR40c1T1代轉基因苗期陽性苗的總RNA，逆轉錄成cDNA。以OsActin為內參基因，對上述轉基因株系1、4、9及WT中OmR40c1的轉錄表達變化進行定量分析。如圖5所示，OmR40c1在轉基因株系1、4及9中均過量表達，其中,在轉基因株系9中的表達量最高。該結果表明OmR40c1在轉基因水稻中成功表達。

2.6轉基因株系的耐鹽性分析

鹽脅迫會導致種子發芽時間推遲、發芽過程延長及發芽率降低等[4]。為了研究鹽脅迫對轉OmR40c1基因水稻的發芽率、表型及株高的影響，我們將去殼的轉OmR40c1基因水稻和野生型日本晴水稻種子分別置于含有174 mmol/L NaCl+和50 mg/L Hyg及含174 mmol/L NaCl的1/2 MS培養基上。然后在智能光照培養箱中(光照12 h，溫度30℃)培養10 d后，統計發芽率和株高。如圖6-A所示，鹽脅迫下的轉OmR40c1基因水稻株高、根系都不同程度受抑，而野生型則更為嚴重。與正常條件相比(圖6-B，表1)，在鹽脅迫下的OmR40c1轉基因水稻的發芽率略有下降；而鹽脅迫下的野生型發芽率僅為其正常情況下的一半左右。在株高方面(圖6-C，表2)，鹽脅迫下的OmR40c1轉基因水稻株高是其在正常條件下的2/5左右；而鹽脅迫下的野生型株高僅為其正常情況下的1/6左右。野生型水稻在鹽脅迫下的發芽率、株高等方面與郭望模[4]的研究結果十分相似。另外，鹽脅迫下的OmR40c1轉基因水稻和野生型植株發育都不同程度受到抑制，但野生型幾乎無法在174 mmol/L NaCl的培養基上誘導生長。

表1鹽脅迫下OmR40c1的發芽率

Table 1. Germination rate of OmR40c1 under salt stress. %

表2鹽脅迫下轉OmR40c1基因水稻的株高

Table 2. Plant height of OmR40c1 transgenic rice under salt stress. cm

A-轉OmR40c1水稻和野生型水稻秧苗在鹽處理前后的表型； B-轉OmR40c1水稻和野生水稻秧苗在鹽處理前后的發芽率； C-轉OmR40c1水稻和野生型水稻秧苗在鹽處理前后的株高。WT-野生型日本晴； T, 174 mmol/L NaCl處理；*顯著性差異(P<0.05)。

A， Phenotype ofOmR40c1 transgenic rice under salt stress; B， Germination ratio ofOmR40c1transgenic plants; C， Height ofOmR40c1transgenic plants. WT， Wild Type; T，Treated with 174 mmol/L NaCl;*Significant differences (P<0.05).

圖6鹽脅迫下OmR40c1轉基因水稻幼苗的發芽率和株高

Fig. 6. Germination rate and plant height of OmR40c1 transgenic rice seedlings under salt stress.

2.7轉基因株系的生理指標

為了研究鹽脅迫對轉OmR40c1基因水稻的葉片、根長、干質量及鮮質量的影響，我們對4周齡的轉OmR40c1基因水稻進行了鹽脅迫處理。如圖7-A所示，鹽脅迫下，水稻的葉片及根部的生長發育受阻，且葉片更為嚴重。無鹽脅迫狀態下，轉基因水稻和野生型水稻的綠色葉片數量基本在10片左右；174 mmol/L NaCl鹽脅迫下，轉基因水稻和野生型水稻的綠色葉片數量基本在2.5片左右，且轉基因水稻的葉片數略微高于野生型(圖7-B，表3)。鹽脅迫下水稻根部的生長受到抑制，兩者的受抑制程度基本相當(圖7-C)。鹽脅迫下，野生型水稻的鮮質量下降更為明顯。我們推測野生型水稻植株內的離子濃度含量相對較低，脫水更為嚴重(圖7-D，表4)。鹽脅迫下，轉基因水稻的鮮質量是干質量的7.9倍左右；野生型植株的鮮質量是干質量的7.1倍左右(圖7-D、E)。該結果暗示鹽脅迫下轉基因水稻體內積累的水分可能比野生型水稻多。

2.8轉基因株系中的K+、Na+含量

對7周齡左右的OmR40c1轉基因和野生型水稻174 mmol/L NaCl處理10 d，然后分別測定實驗組和對照組中轉基因水稻與野生型水稻植株內的K+、Na+含量。如圖8-A所示，鹽脅迫前后，轉基因水稻與野生型水稻體內的K+含量沒有顯著的變化，但轉基因水稻中的K+含量是野生型水稻植株內K+的1.25倍。無鹽脅迫狀態下，轉基因水稻與野生型水稻植株內的Na+含量沒有明顯差異；鹽脅迫下，轉基因水稻植株內的Na+含量約是野生型體內Na+含量的1.38倍(圖8-B)。該結果暗示OmR40c1可能通過細胞膜協助Na+的運輸，以維持細胞內外離子滲透壓的平衡。

表3鹽脅迫下轉OmR40c1基因水稻的綠葉數和根長

Table 3． Number of green leaves and length of roots of OmR40c1 trangenic rice under salt stress.

處理TreatmentNaCl濃度NaClconcentration/(mmol·L-1)綠葉數Numberofgreenleaves野生型WildtypeOmR40c1根長Rootlength/cm野生型WildtypeOmR40c1對照CK010.5±0.4310.03±0.4820.15±1.3618.77±0.93鹽脅迫Saltstress1743.0±0.863.65±1.1511.86±0.6911.13±0.67

表4鹽脅迫下轉OmR40c1基因水稻植株的鮮質量和干質量

Table 4． Fresh and dry weight of OmR40c1 trangenic rice under salt stress.

處理TreatmentNaCl濃度NaClconcentration/(mmol·L-1)鮮質量Freshweight/g野生型WildtypeOmR40c1干質量Dryweight/g野生型WildtypeOmR40c1對照CK07.04±1.365.67±0.950.75±0.300.58±0.08鹽脅迫Saltstress1743.66±0.412.85±0.510.52±0.090.37±0.08

3討論

水稻是一種對鹽中度敏感的作物，土壤鹽漬化是限制鹽堿稻區水稻穩產的主要限制因素。培育耐鹽/堿水稻品種是發展鹽/堿稻區生產最為經濟有效的途徑之一，而基因工程技術是培育耐鹽/堿水稻品種的主要方法之一。近年來，水稻耐鹽轉基因的研究取得了一些進展。OsCPK7是一個鈣離子激酶，該酶可能通過保護細胞膜被氧化而增強轉基因株系的耐鹽性[28]。AgNHX1是一個反鹽轉運體，轉AgNHX1的水稻能在300 mmol/L的NaCl中存活3 d左右[29]。OsTZF1是一個鋅指蛋白，該轉錄因子可通過調控鹽脅迫基因的表達而增強水稻的耐鹽性[30]。

A-7周左右的轉OmR40c1水稻和野生型日本晴在鹽脅處理下的表型; B-鹽脅迫下轉OmR40c1水稻和野生型日本晴綠葉數； C-鹽脅迫下轉OmR40c1水稻和野生型日本晴根長； D-鹽脅迫下后轉OmR40c1水稻和野生型日本晴植株鮮質量； E-鹽脅迫下轉OmR40c1水稻和野生型日本晴干質量。WT-野生型日本晴； 0, 0 mmol/L NaCl； 174, 174 mmol/L NaCl；*顯著性差異。

A, Phenotype ofOmR40c1transgenic rice under salt stress; B, Number of green leaves ofOmR40c1transgenic rice under salt stress; C, Length of root ofOmR40c1transgenic rice under salt stress; D, Fresh weight ofOmR40c1transgenic rice under salt stress; E, Dry weight ofOmR40c1transgenic rice under salt stress. WT, Wild type of Nipponbare. 0, 0 mmol/L NaCl； 174, 174 mmol/L NaCl.*Significant difference.

圖7鹽脅迫下OmR40c1轉基因水稻的生理指標

Fig. 7. Physiological indexes of OmR40c1 trangenic rice under salt stress.

A-7周左右的轉OmR40c1水稻型和野生水稻在鹽脅處理下的K+濃度； B-7周左右的轉OmR40c1水稻和野生型水稻在鹽脅處理下的Na+濃度； 0, 0 mmol/L NaCl； 174, 174 mmol/L NaCl；*顯著性差異。

A, Concentration of K+inOmR40c1transgenic rice under salt stress; B, Concentration of Na+inOmR40c1transgenic rice under salt stress. WT, Wild type of Nipponbare; 0, 0 mmol/L NaCl； 174, 174 mmol/L NaCl；*Significant difference.

圖8鹽脅迫下轉OmR40c1基因水稻的K+、Na+濃度

Fig. 8. Concentrations of K+and Na+in OmR40c1 transgenic rice under salt stress.

本研究從疣粒野生稻克隆到的OmR40c1基因，其CDS區域與OsR40c1相同，而在UTR區域有差異。OsR40c1是一個受ABA和鹽脅迫誘導表達的Ricin_B(蓖麻凝集素-β亞基)蛋白，且定位于細胞膜及細胞核上。OmR40c1能提高種子的發芽率，可能參與種子的萌發過程。該結果與郭望模[4]和李南羿[31]研究結果類似。鹽脅迫下，轉OmR40c1水稻小苗的株高僅為正常株高的一半左右，野生型株系的發育則受到嚴重的抑制。鹽脅迫下，轉OmR40c1水稻和野生型水稻的葉片褪綠，根部發育受到明顯的抑制；轉OmR40c1水稻和野生型水稻的鮮質量都干質量都顯著下降。該結果與黑倩的研究結果類似[32]。

轉OmR40c1水稻植株內K+富集能力是野生型的1.25倍。鹽脅迫下，轉OmR40c1水稻植株內的Na+富集能力是野生型的1.38倍。我們推測位于細胞膜上的OmR40c1蛋白，可能參與Na+的跨膜運輸來維持細胞內外的離子滲透壓，進而提高水稻的耐鹽性。具體的耐鹽性分子機理，有待進一步研究。

參考文獻：

[1]Shi H, Xiong L, Stevenson B, et al. TheArabidopsissalt overly sensitive 4 mutants uncover a critical role for vitamin B6 in plant salt tolerance.PlantCell, 2002, 14(3): 575-588.

[2]祁棟靈, 韓龍植, 張三元. 水稻耐鹽堿性鑒定評價方法. 植物遺傳資源學報, 2005(2): 226-230.

Qi D L, Han L Z, Zhang S Y. Methods of characterization and evaluation of salt or alkaline tolerance in rice.JPlantGenetResour, 2005(2): 226-230.(in Chinese with English abstract)

[3]Maggio A, Barbieri G, Raimondi G, et al. Contrasting effects of GA3treatments on tomato plants exposed to increasing salinity.JPlantGrowthRegul, 2010, 29(1): 63-72.

[4]郭望模, 傅亞萍, 孫宗修. 水稻芽期和苗期耐鹽指標的選擇研究. 浙江農業科學, 2004(1): 30-33.

Guo W M, Fu Y P, Sun Z X. Salt tolerance evaluation indices of rice at its germinating and seedling stages.JZhejiangAgricSci, 2004(1): 30-33.(in Chinese with English abstract)

[5]孫健, 王敬國, 劉化龍,等. 鹽脅迫下水稻苗高和分蘗數的發育動態QTL分析. 核農學報, 2015, 29(2): 235-243.

Sun J, Wang J G, Liu H L, et al. Dynamic QTL analysis of rice seedling height and tiller number under salt stress.JNuclAgicSci. 2015,29(2): 235-243.(in Chinese with English abstract)

[6]余為仆. 秸稈還田條件下鹽脅迫對水稻產量與品質形成的影響. 揚州: 揚州大學, 2014: 30-39.

Yu W P. Effect of salt stress associated with straw returning on yield and quality of rice. Yangzhou: Yangzhou University, 2014: 30-39.(in Chinese with English abstract)

[7]Wang W, Vinocur B, Altman A. Plant responses to drought, salinity and extreme temperatures: Towards genetic engineering for stress tolerance.Planta, 2003, 218(1): 1-14.

[8]Yamane K, Rahman MS, Kawasaki M, et al. Pretreatment with antioxidants decreases the effects of salt stress on chloroplast ultrastructure in rice leaf segments (OryzasativaL.).PlantProdSci, 2004, 7(3): 292-300.

[9]王仁雷, 華春, 羅慶云, 等. 鹽脅迫下水稻葉綠體中Na+、Cl-積累導致葉片凈光合速率下降. 植物生理與分子生物學學報, 2002, 28(5): 385-390.

Wang R L, Hua Chun, Luo Q Y, et al. Na+and Cl-accumulation in chloroplasts results in a decrease in net photosynthetic rate in rice leaves under salt stress.JPlantPhysiolMolBiol, 2002, 28(5): 385-390.(in Chinese with English abstract)

[10]Lin J, Wang Y, Wang G. Salt stress-induced programmed cell death in tobacco protoplasts is mediated by reactive oxygen species and mitochondrial permeability transition pore status.JPlantPhysiol, 2006, 163(7): 731-739.

[11]蘇芳莉, 李海福, 陳曦, 等. 鹽脅迫對蘆葦細胞超微結構的影響. 西北植物學報, 2012, 31(11): 2216-2221.

Su F L, Li H F, Chen X, et al. Effect of salt stress on the ultrastructure of reed cell.ActaBotBororealOccidentSin, 2012, 31(11): 2216-2221.(in Chinese with English abstract)

[12]張振華, 劉強, 宋海星, 等. K+,Ca2+和Mg2+對不同水稻(OryzasativaL.)基因型苗期耐鹽性的影響. 中國農業科學, 2010, 43(15): 3088-3097.

Zhang Z H, Liu Q, Song H X, et al. The salinity tolerance of rice (OryzasativaL.) genotypes as affected by nutrients (K+, Ca2+and Mg2+) at seedling stage.ChinaAgricSci, 2010, 43(15): 3088-3097.(in Chinese with English abstract)

[13]Yuan H J, Ma Q, Wu G Q, et al. ZxNHX controls Na+and K+homeostasis at the whole-plant level inZygophyllumxanthoxylumthrough feedback regulation of the expression of genes involved in their transport.AnnalsBot, 2015,115(3): 495-507.

[14]Deinlein U, Stephan A B, Horie T, et al. Plant salt-tolerance mechanisms.TrendsPlantSci, 2014, 19(6): 371-379.

[15]Geng Y, Wu R, Wee CW, et al. A spatio-temporal understanding of growth regulation during the salt stress response inArabidopsis.PlantCell, 2013,25(6): 2132-2154.

[16]Jabeen N, Ahmad R. The activity of antioxidant enzymes in response to salt stress in safflower (CarthamustinctoriusL.) and sunflower (HelianthusannuusL.) seedlings raised from seed treated with chitosan.JSciFoodAgric, 2013, 93(7): 1699-1705.

[17]Xu G Y, Rocha P S, Wang M L, et al. A novel rice calmodulin-like gene, OsMSR2, enhances drought and salt tolerance and increases ABA sensitivity inArabidopsis.Planta, 2011, 234(1): 47-59.

[18]Kumari S, Joshi R, Singh K, et al. Expression of a cyclophilin OsCyp2-P isolated from a salt-tolerant landrace of rice in tobacco alleviates stress via ion homeostasis and limiting ROS accumulation.Funct&IntegrGenom, 2015,15(4): 395-412.

[19]Yang A, Dai X, Zhang WH. A R2R3-type MYB gene,OsMYB2, is involved in salt, cold, and dehydration tolerance in rice.JExpBot, 2012, 63(7): 2541-2556.

[20]Barrero J M, Rodriguez PL, Quesada V, et al. Both abscisic acid (ABA)-dependent and ABA-independent pathways govern the induction of NCED3,AAO3 andABA1 in response to salt stress.Plant,Cell&Environ, 2006, 29(10): 2000-2008.

[21]Moons A, Gielen J, Vandekerckhove J, et al. An abscisic-acid- and salt-stress-responsive rice cDNA from a novel plant gene family.Planta. 1997,202(4): 443-454.

[22]Rio D C, Ares M, Jr., Hannon G J, et al. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent).ColdSpringHarborProtoc, 2010, 2010(6): pdb.prot5439.

[23]周潔, 王栩鳴, 陳斌, 等. 基于Gateway技術的低成本植物雙分子熒光互補分析系統. 浙江農業學報, 2013, 25(5): 1024-1030.

Zhou J, Wang X M, Chen B, et al. Low-cost gateway-compatible bimolecular fluorescence complementation assay system.ActaAgricZhejiangensis, 2013, 25(5): 1024-1030.(in Chinese with English abstract)

[24]Sambrook J, Russell D W. The inoue method for preparation and transformation of competentE.coli: “Ultra-competent”cells.CSHProtocols, 2006, 2006(1): 1-6.

[25]李茹, 周潔, 李冬月, 等. 水稻 OsWRKY7基因的表達研究. 中國水稻科學, 2015, 29(6): 559-570.

Li R, Zhou J, Li D Y, et al. Expression ofOsWRKY7 in rice.ChinJRiceSci, 2015, 29(6): 559-570.(in Chinese with English abstract)

[26]Gao C, Long D, Lenk I, et al. Comparative analysis of transgenic tall fescue (FestucaarundinaceaSchreb.) plants obtained byAgrobacterium-mediated transformation and particle bombardment.PlantCellRep, 2008, 27(10): 1601-1609.

[27]Wang H, Qi M, Cutler A J. A simple method of preparing plant samples for PCR.NucleicAcidsRes, 1993, 21(17): 4153-4154.

[28]Ye S, Wang L, Xie W, et al. Expression profile of calcium-dependent protein kinase (CDPKs) genes during the whole lifespan and under phytohormone treatment conditions in rice (OryzasativaL. ssp.indica).PlantMolBiol, 2009, 70(3): 311-325.

[29] Ohta M, Hayashi Y, Nakashima A, et al. Introduction of a Na+/H+antiporter gene from Atriplex gmelini confers salt tolerance to rice.FEBSLett. 2002, 532(3): 279-282.

[30]Jan A, Maruyama K, Todaka D, et al. OsTZF1, a CCCH-tandem zinc finger protein, confers delayed senescence and stress tolerance in rice by regulating stress-related genes.PlantPhysiol, 2013, 161(3): 1202-1216.

[31] 李南羿, 郭澤建. 轉錄因子OPBP1和OsiWRKY基因的超表達提高水稻的耐鹽及抗病能力. 中國水稻科學, 2006, 20(1):13-18.

LI N Y, GUO Z J. Overexpression of two different transcription factors, OPBP1 and OsiWRKY, enhances resistance against pathogen attack and salt stress in rice.ChinJRiceSci, 2006, 20(1): 13-18.(in Chinese with English abstract)

[32]黑倩, 張輝, 黃繼斌, 等. 過量表達AtNHXS1新基因顯著提高水稻的耐鹽性. 華中農業大學學報, 2012, 31(5): 529-535.

Hei Q,Zhang H, Huang J B, et al. Overexpress on a shuffled Na+/H+antiporter geneAtNHXS1 improving salt tolerance of rice(OryzasativeL.).JHuazhongAgricUniv, 2012, 31(5): 529-535.

收稿日期:2016-01-08； 修改稿收到日期: 2016-05-18。

基金項目:國家基礎研究計劃資助項目(2014CB1603090)； 國家863計劃資助項目(2014AA0A603-15)； 浙江省自然科學基金資助項目(LZ14C140001， LZ2013C1109)。

中圖分類號:Q755; Q945.78; S511.02

文獻標識碼:A

文章編號:1001-7216(2016)04-0335-10

Over-expression ofOmR40c1, a Ricin_B Lectin fromOryzameyerianaL. Enhances Salt Tolerance in Transgenic Plants

CHEN Xian1,2, DONG Yan2,3, ZHOU Jie2, WANG Xu-ming2, YAN Cheng-qi2,*, CHEN Jian-ping1,2,*

(1College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China;2Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;3College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;*Corresponding author, E-mail: jpchen2001@126.com, yanchengqi@163.com)

Abstract:Salt stress is a major environmental factor limiting rice growth and productivity in saline soil. Planting tolerant line is still the most effective way in response to salt stress. OsR40c1is an abscisic acid (ABA) and salt stress-induced gene. However, the function of OmR40c1is poorly studied. Here, we cloned a gene from Oryza meyeriana which shared the same CDS with OmR40c1but differed in 5′&3′ UTR. Subcellular location analysis showed that OmR40c1was located in cytoplasmic membrane and nuclear. OmR40c1 overexpressing transgenic rice was obtained by using the Agrobacterium-mediated gene transfer system. OmR40c1might involve in seed germination. The germination rate of OmR40c1 transgenic rice was slightly affected by salt stress, while wild type decreased about 50% compared with their mocks. The seedlings of wild type hardly grown on the 1/2 MS medium with salt (174 mmol/L NaCl), the height of 10-day OmR40c1 transgenic rice seedling decreased more than a half. Green leaves and root of OmR40c1 and wild type rice were both seriously affected by salt stress. The concentration of Na+in OmR40c1 was about 1.38 times higher than that in wild type, together with a slight rise in the K+ concentration and the results suggest that OmR40c1 may act as a salt tolerance gene in enhancing rice salt tolerance especially at the adult stage.

Key words:Oryza meyeriana； OmR40c1； transgenic rice； salt tolerance