水飛薊素對人骨肉瘤Saos-2細胞的抑制作用及相關機制

嚴　晨，鄔亞華，王子瑤，殷嫦嫦，殷　明

(南昌大學1.第二附屬醫院、2.研究生院醫學部，江西 南昌　330006；3.九江學院，江西 九江　332000)

?

水飛薊素對人骨肉瘤Saos-2細胞的抑制作用及相關機制

嚴晨1,2，鄔亞華3，王子瑤1,2，殷嫦嫦3，殷明1

(南昌大學1.第二附屬醫院、2.研究生院醫學部，江西 南昌330006；3.九江學院，江西 九江332000)

目的研究水飛薊素對人骨肉瘤Saos-2細胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。方法設置對照組及不同濃度水飛薊素組，作用人骨肉瘤Saos-2細胞。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化；CCK-8法測定細胞增殖；流式細胞儀檢測細胞凋亡；Western blot檢測ERK1/2、p-ERK1/2及cleaved caspase-3蛋白表達。結果水飛薊素抑制Saos-2細胞增殖，呈時間及濃度依賴性；水飛薊素誘導Saos-2細胞凋亡，呈濃度依賴性；水飛薊素降低Saos-2細胞p-ERK1/2蛋白表達，增加Saos-2細胞cleaved caspase-3蛋白表達，呈濃度依賴性，而ERK1/2蛋白表達無明顯變化。結論水飛薊素能夠抑制人骨肉瘤Saos-2細胞增殖及誘導其凋亡，其作用機制可能與抑制ERK信號通路及上調caspase-3蛋白表達有關。

水飛薊素；骨肉瘤；增殖；凋亡；機制；ERK信號通路；caspase-3

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是最常見的原發性惡性骨腫瘤，多發于兒童及青少年[1]。目前，OS的主要治療策略為手術切除聯合化療。近年來統計，無轉移OS患者的總生存率能達到70%，而出現肺轉移或骨轉移，生存率只有25%～50%[2]，且大劑量使用化療藥物產生嚴重的毒副作用及耐藥的頻繁發生，使得OS患者的生存率并沒有得到明顯提高，因此，OS的治療需進一步探討。研究發現，一些中藥也具有抑制腫瘤細胞的作用，且毒副作用小，可作為傳統化療藥物的輔助用藥或聯合使用，以增加化療藥物的敏感性或減少其用量，以更好的抗OS治療。

水飛薊素(silymarin，SM)是從植物水飛薊中提取的一種活性成分，為多酚類黃酮，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、肝細胞再生等作用，臨床已運用其治療肝臟疾病[3]。近年來研究發現，SM對乳腺癌、皮膚癌、前列腺癌、宮頸癌、結腸直腸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肺癌具有抑制作用[4-6]，但對OS的作用尚不清楚。本實驗研究SM對OS的作用，并進一步探討其可能的作用機制。

1　材料

1.1細胞系人骨肉瘤Saos-2細胞為本實驗室庫存。

1.2主要藥品與試劑水飛薊素(山東西亞生化科技有限公司，批號1035907)；DMSO(Solarbio公司，美國，批號02A033)；胰酶(Solarbio公司，美國，批號20150806)；α-MEM(Hyclone公司，美國，批號NAP1372)；胎牛血清(Hyclone公司，美國，批號：NYM1035)；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(上海經科化學科技有限公司，批號：JK-021)；Annexin V-FITC /PI凋亡檢測試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司，批號：150509J)；總蛋白提取試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司，批號：P1250)；兔抗人ERK1/2單克隆抗體(Cell Signaling公司，美國，批號：14)；p-ERK1/2單克隆抗體(Cell Signaling公司，美國，批號：15)；兔抗人GAPDH(Proteintech公司，美國，批號：10494-1-AP)；cleaved caspase-3多克隆抗體(Proteintech公司，美國，批號：9677-1-AP)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(北京康為世紀生物科技有限公司，批號：1215E)。

2　方法

2.1細胞培養人骨肉瘤Saos-2細胞從液氮中復蘇后，用10%胎牛血清的α-MEM培養基，置于37℃ 5% CO2的培養箱中培養，每3 d換液1次，待細胞匯合80%～90%后，按1 ∶3傳代、培養或進行相關實驗。

2.2倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化取對數生長期Saos-2細胞，按每孔5×104接種于24孔板中，常規培養24 h后，按照實驗分組更換含不同藥物濃度的培養基，實驗分6組：0 μmol·L-1(對照組)、40、80、120、160、200 μmol·L-1，作用48 h后，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態，并拍照。

2.3CCK-8法測定細胞增殖取對數生長期Saos-2細胞，按每孔5×103接種于96孔板中，常規培養24 h后，按照實驗分組更換含不同藥物濃度的培養基，實驗分組同2.2，各藥物濃度組均設3個復孔和1個空白孔，分別作用24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37℃培養箱中孵育2 h，酶標儀(波長450 nm)測定各孔吸光度OD(A)值。各組吸光度OD=A細胞-A空白，細胞增殖抑制率(inhibition rate, IR)：IR/%=(1-OD實驗/OD對照)×100%。

2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡取對數生長期Saos-2細胞，按每孔5×105接種于6孔板中，常規培養24 h后，按照實驗分組更換含不同藥物濃度的培養基，實驗分組同2.2，作用48 h后，消化收集細胞，用PBS重新懸浮細胞，并計數，各組取2×105細胞懸浮液，1 500 r·min-1，5 min離心后棄上清，加入500 μL 1×Binding Buffer輕輕重懸細胞，重懸后，先加入5 μL Annexin V-FITC，再加入10 μL PI，輕輕混勻，在室溫下，避光反應10 min，行流式細胞儀檢測，計算凋亡率。

2.5Western blot檢測細胞內ERK1/2、p-ERK1/2及cleaved caspase-3蛋白表達取對數生長期Saos-2細胞，按每孔5×105接種于6孔板中，常規培養24 h后，按照實驗分組更換含不同藥物濃度的培養基，實驗分4組：對照組(0 μmol·L-1)、低濃度組(40 μmol·L-1)、中濃度組(120 μmol·L-1)、高濃度組(200 μmol·L-1)，作用48 h后，常規消化收集各組細胞，按總蛋白抽提試劑盒操作說明提取各組細胞總蛋白，行聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉膜，5% BSA封閉，孵育一抗GAPDH(1 ∶4 000)、ERK1/2(1 ∶1 000)、p-ERK1/2(1 ∶2 000)、cleaved caspase-3(1 ∶1 000)，4℃過夜，1×TBTS洗膜3次，孵育二抗(1 ∶6 000)，1×TBTS 洗膜3次，暗室膠片曝光，條帶用Image J軟件進行灰度分析。

3　結果

3.1細胞形態學觀察顯微鏡下觀察顯示：對照組細胞生長良好，呈梭形或不規則形，胞質透亮，胞膜光整；處理組部分細胞體積縮小、變圓，細胞內顆粒增多，胞膜邊緣毛糙，折光度增強，呈細胞凋亡樣形態學改變；處理組細胞數量減少，細胞間隙增寬，可見少許細胞脫壁、漂浮，隨著濃度的增大，處理組上述形態學改變越明顯(Fig 1 )。

A: Control group(0 μmol·L-1); B:40 μmol·L-1;C:80 μmol·L-1; D:120 μmol·L-1; E:160 μmol·L-1; F:200 μmol·L-1

Fig 2　Apoptosis rate of Saos-2 cells treated with silymarin

*P<0.05vscontrol

3.2水飛薊素對骨肉瘤Saos-2細胞增殖的影響CCK-8結果顯示：處理組均抑制骨肉瘤Saos-2細胞增殖，藥物濃度越大，作用時間越長，增殖抑制越明顯，與對照組相比差異有顯著性(P<0.05)，見Tab 1。

GroupIR/%(24h)IR/%(48h)IR/%(72h)Control00040μmol·L-110.16±2.31*14.96±2.89*18.34±1.93*80μmol·L-124.42±4.42*34.05±2.03*41.41±4.35*120μmol·L-152.01±7.81*65.01±2.78*71.62±4.44*160μmol·L-168.01±3.44*76.92±4.51*83.96±3.52*200μmol·L-180.50±2.93*87.58±2.07*92.22±2.80*

*P<0.05vscontrol

3.3水飛薊素對骨肉瘤Saos-2細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結果顯示：水飛薊素誘導細胞凋亡，各組細胞凋亡率分別為(2.08±0.12)%、(8.15±0.37)%、(15.37±1.06)%、(32.68±2.02)%、(48.34±1.59)%、(67.58±2.43)%，處理組濃度越高，凋亡率越大，與對照組比差異有顯著性(P<0.05),見Fig 2。

3.4水飛薊素對骨肉瘤Saos-2細胞ERK1/2、p-ERK1/2及cleaved caspase-3蛋白表達的影響Western blot結果顯示：水飛薊素降低Saos-2細胞內p-ERK1/2蛋白表達，增加cleaved caspase-3蛋白表達，與對照組相比差異有顯著性(P<0.05)，而ERK1/2蛋白表達無明顯變化(Fig 3)。

4　討論

研究證實[7-10]，水飛薊素具有預防癌癥發生及抗腫瘤作用，毒副作用小，還能增加多柔比星、順鉑和卡鉑的敏感性。本研究CCK-8及流式檢測結果顯示，水飛薊素能夠抑制Saos-2細胞增殖并誘導其凋亡，并呈濃度依賴性。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是一類絲氨酸/酪氨酸蛋白激酶，廣泛存在于哺乳動物細胞內，MAPKs信號通路為細胞內重要信號轉導通路，參與調控細胞的存活、生長、增殖、分化及凋亡等多項生理過程[11]。非磷酸化的MAPKs為靜息狀態，而磷酸化的MAPKs為激活狀態，當MAPKs信號通路受到上游激酶作用下，發生磷酸化后而被激活，進一步激活下游轉錄因子，啟動相關基因及蛋白表達，發揮生物學效應。研究發現，多種惡性腫瘤中MAPKs信號通路過表達或過激活，如：肝癌、腎癌、胰腺癌、食管癌[12-16]。MAPKs主要包括3個亞家族：ERK(extracellular signal-regulated kinase)家族、JNK(C-JUN-N terminal kinase)家族、p38家族，其中ERK與細胞的生長、增殖密切相關。有研究報道，水飛薊素可通過MAPKs信號轉導通路促進肺腺癌A549細胞凋亡，其中ERK1/2磷酸化明顯受到抑制[17]。徐良志等[18]研究發現，大黃素通過抑制ERK信號通路，抑制骨肉瘤細胞增殖，導致細胞凋亡。caspase家族是一組半胱氨酸蛋白酶，在介導細胞凋亡過程中起到重要的作用。細胞凋亡途徑有多種，但絕大多數途徑末端都是通過caspase的級聯激活，最終激活caspase-3，形成具有活性的cleaved caspase-3片段，進一步產生一系列級聯反應，導致細胞凋亡[19]。施劍明等[20]研究發現，槲皮素、順鉑能增加骨肉瘤MG-63細胞cleaved caspase-3蛋白表達，抑制細胞增殖及促進其凋亡。本研究中，水飛薊素作用骨肉瘤Saos-2細胞48h后，p-ERK1/2蛋白表達降低，cleaved caspase-3蛋白表達增加，呈濃度依賴性，而ERK1/2蛋白表達無明顯變化,表明水飛薊素能夠抑制ERK磷酸化，阻滯ERK信號傳導通路，同時上調caspase-3蛋白表達。

Fig 3　Cleaved caspase-3,ERK1/2,p-ERK1/2 protein expression of Saos-2 cells treated with silymarin for 48h detected by Western ±s,n=4)

綜上所述，水飛薊素能夠抑制Saos-2細胞增殖及誘導其凋亡，可能與抑制ERK信號通路及上調caspase-3蛋白表達有關。本研究為水飛薊素抗骨肉瘤及其作用靶點提供一定的實驗參考。

(致謝:本實驗在九江學院醫學轉化實驗室完成，感謝實驗室全體成員對本實驗的支持與幫助！)

[1]Miwa S, Sugimoto N, Yamamoto N, et al. Caffeine induces apoptosis of osteosarcoma cells by inhibiting AKT/mTOR/S6K, NF-κB and MAPK pathways[J].AnticancerRes, 2012, 32(9): 3643-9.

[2]Liu Y, He J, Chen X, et al. The proapoptotic effect of formononetin in human osteosarcoma cells: involvemt of inactivation of ERK and Akt pathways[J].CellPhysiolBiochem, 2014, 34(3):637-45.

[3]Saller R, Meier R, Brignoli R. The use of silymarin in the treatment of liver diseases[J].Drugs,2001,61(14)2035-63.

[4]Agarwal R, Agarwal C, Ichikawa H, et al. Anticancer potential of silymarin: from bench to bed side[J].AnticancerRes, 2006, 26(6B): 4457-98.

[5]Singh R P, Agarwal R. Prostate cancer chemoprevention by silibinin: bench to bedside[J].MolCarcinog, 2006, 45(6): 436-42.

[6]Singh R P, Agarwal R. A cancer chemopreventive agent silibinin, targets mitogenic and survival signaling in prostate cancer[J].MutatRes, 2004, 555(1-2): 21-32.

[7]Saxena A, Saxena A K, Singh J, et al. Natural antioxidants synergistically enhance the anticancer potential of AP9-cd, a novel lignan composition from Cedrus deodara in human leukemia HL-60 cells[J].ChemBiolInteract, 2010, 188(3): 580-90.

[8]Deep G, Gangar S C, Oberlies N H, et al. Isosilybin A induces apoptosis in human prostate cancer cells via tageting Akt, NF-κB, and androgen receptor signaling[J].MolCarcinog, 2010, 49(10): 902-12.

[9]Kaur M, Velmurugan B, Tyagi A, et al. Silibinin suppresses growth of human colorectal carcinoma SW480 in culture and xenograft through down-regulation of beta-catenin-dependent signaling[J].Neoplasia,2010,12(5): 415-24.

[10]Cheung C W, Gibbons N, Johnson D W, Nicol D L. Silibinin-a promising new treatment for cancer[J].AnticancerAgentsMedChem, 2010, 10(3): 186-95.

[11]鐘良瑞, 魏克民. 三葉青黃酮對肺癌A549 細胞生長抑制與MAPKs 通路關系的研究[J]. 中國藥理學通報, 2014, 30(1): 101-4.

[11]Zhong L R,Wei K M. Radix tetrastigma hemsleyani flavone suppresses human lung carcinomaA549 cell by regulating MAPKs pathway[J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(1): 101-4.

[12]Young A, Lyons J. Ras signaling and therapies[J].AdvCancerRes, 2009, 102: 1-17.

[13]Wang C, Maass T, Krupp M, et al. A systems biology perspective on cholangiocellular carcinoma development: focus on MAPK-signaling and the extracellular environment[J].JHepatol, 2009, 50(6): 1122-31.

[14]Ding Y, Boguslawski E A, Berghuis B D, et al. Mitogen-activated protein kinase kinase signaling promotes growth and vascularization of fibrosarcoma[J].MolCancerTher, 2008, 7(3): 648-58.

[15]Peng C L, Guo W, Ji T, et al. Sorafenib induces growth inhibition and apoptosis in human synovial sarcoma cells via inhibiting the RAF/MEK/ERK signaling pathway[J].CancerBiolTher, 2009, 8(18): 1729-36.

[16]Keswani R N, Chumsangsri A, Mustafi R, et al. Sorafenib inhibits MAPK-mediated proliferation in a Barrett′s esophageal adenocarcinoma cell line[J].DisEsophagus, 2008,21(6): 514-21.

[17]李文海，梁軍，王春梅，等. 水飛薊素可通過MAPK信號轉導通路促進肺腺癌A549細胞凋亡[J]. 第四軍醫大學學報, 2008, 29(5): 461-4.

[17]Li W H, Liang J, Wang C M, et al. Apoptosis of lung adenocarcinama cell line A549 promoted by silymarin through MAPK signal transduction pathway[J].JFourthMilMedUniv, 2008, 29(5): 461-4.

[18]徐良志, 陳昆侖. 大黃素對骨肉瘤細胞增殖的抑制及相關機制[J].山東大學醫學版, 2014, 52(6):37-40.

[18]Xu L Z, Chen K L. Inhibitory effect and its mechanism of emodin on the proliferation of human osteosarcoma cellline[J].JShanDongUniv(HeaSci),2014,52(6):37-40.

[19]劉金娟, 楊成流, 陳永強, 等. 魚腥草地下莖提取物誘導胃癌細胞SGC-7901凋亡機制的研究[J]. 中國藥理學通報, 2014, 30(2): 257-61.

[19]Liu J J, Yang C L, Chen Y Q, et al. Mechanism of SGC-7901 apoptosis induced by Houttuynia cordata thunb subterraneous stem extraction[J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(2): 257-61.

[20]施劍明, 殷嫦嫦, 孫維君, 等. 槲皮素聯合順鉑對人骨肉瘤MG63細胞增殖及凋亡的影響[J]. 中國藥理學通報, 2014, 30(10): 1361-6.

[20]Shi J M, Yin C C, Sun W J, et al. Effect of quercetin combined with cisplatin on proliferation and opoptosis of human osteosarcoma cell MG63[J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(10): 1361-6.

Inhibitory effect of silymarin on human osteosarcoma Saos-2 cells and its mechanism

YAN Chen1,2, WU Ya-hua3, WANG Zi-yao1,2, YIN Chang-chang3, YIN Min1

(1.TheSecondAffiliatedHospitaltoNanchangUniversity，2.MedicalGraduateSchoolofNanchangUniversity，Nanchang330006,China；3.JiujiangCollege,JiujiangJiangxi332000,China)

AimTo study the effect of silymarin on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma saos-2 cells and to explore its possible mechanisms.MethodsControl group and different concentration groups of silymarin were set, and Saos-2 cells were treated with silymarin. Celluar morphologic changes were observed by inverted phase contrast microscope. Proliferation of cells was tested CCK-8 assay. Apoptosis rate of cells was analyzed by flow cytometry. ERK1/2、p-ERK1/2 and cleaved caspase-3 protein expression were measured by Western blot.ResultsSilymarin inhibited the proliferation of Saos-2 cells in a time-dependent and concentration-dependent manner. Silymarin induced the apoptosis of Saos-2 cells in a concentration-dependent manner. Silymarin decreased p-ERK1/2 protein expression and increased cleaved caspase-3 protein expression in a concentration-dependent manner, while ERK1/2 protein expression had no obvious change.ConculsionsSilymarin can inhibit the proliferation of human osteosarcoma saos-2 cells and induce apoptosis of them, and the mechanism may be related to inhibition of ERK signaling pathway and upregulated caspase-3 protein expression.

silymarin; osteosarcoma; proliferation; apoptosis; mechanism; ERK signaling pathway; caspase-3

2016-02-21，

2016-04-14

國家自然科學基金資助項目(No 81160226)

嚴晨(1986-)，男，碩士生，研究方向：中藥抗骨腫瘤，E-mail:yanchen8623@163.com；殷明(1958-)，男，教授，主任醫師，博士生導師，研究方向：脊柱與腫瘤，通訊作者，E-mail: yinming0791@aliyun.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.016

A

1001-1978(2016)07-0966-05

R284.1；R329.24；R329.25；R738.302.2

網絡出版時間：2016-6-20 11:49網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160620.1149.032.html