GSNO對人鼻咽癌細胞增殖的影響

湛　亞，王淑琪，何莎莎，王　穎，劉姬艷

(杭州師范大學生命與環境科學學院，浙江 杭州 310036)

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GSNO對人鼻咽癌細胞增殖的影響

湛亞，王淑琪，何莎莎，王穎，劉姬艷

(杭州師范大學生命與環境科學學院，浙江 杭州 310036)

摘要：采取GSH和NaNO2(1∶1)在酸性避光條件下反應的方法合成GSNO，用已構建的人鼻咽癌細胞(CNE-2)為模型，研究GSNO對CNE-2細胞增殖的影響.結果表明：NO能明顯抑制CNE-2細胞增殖，200 μmol/L GSNO作用CNE-2細胞，12 h抑制率為19.1%，24 h抑制率為30.4%.在一定濃度范圍內，GSNO抑制CNE-2細胞的生長增殖效果與作用時間和濃度相關.

關鍵詞：亞硝基谷胱甘肽；人鼻咽癌細胞株；MTT檢測法

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國南方常見的惡性腫瘤之一，為耳鼻喉科最常見的惡性腫瘤，每年發病率高達25～30/10萬人[1].鼻咽癌的發病因素與多種致癌因素相關，如EB病毒感染、環境因素、遺傳因素、飲食習慣等[2].目前臨床使用的化學藥物雖然在腫瘤治療方面取得一定的療效，但遠期效果不理想并存在有嚴重的毒副反應[3].

Hibbs發現由活化的巨噬細胞產生的一氧化氮(NO)是殺傷腫瘤細胞的毒性效應因子以來，已有大量資料證明，NO在腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲、轉移及凋亡中也起著重要作用[4-8].NO是一種小分子物質，可溶于水，具有親脂性，可穿透生物膜.作為一種自由基性質的氣體，NO可作用于細胞內的靶分子而參與一系列生理和病理條件下的生物過程，調節免疫、神經、循環等一系列生理活動，如宿主防御反應、血管通透性、血管擴張、神經信號傳遞等[9-15].內源性NO是一種極不穩定的化合物，在實驗條件下，其半衰期僅為3～5 s，對研究其功能帶來不便.亞硝基谷胱甘肽(nitrosoglutathione, GSNO)比NO穩定，半衰期長，具脂溶性特征，可穿透細胞膜進入細胞并釋放NO，進而使NO發揮其生物學活性[16].本研究以NO供體GSNO作為工具藥，用已構建的人鼻咽癌細胞(Human nasopharyngeal carcinoma cell, CNE-2)為模型，研究GSNO對CNE-2細胞增殖的影響.

1材料和方法

1.1實驗材料及儀器

CNE-2細胞株系(浙江醫院饋贈)，還原性谷胱甘肽(GSH)(上海晶純生化科技股份有限公司)，N-乙酰半胱氨酸(NAC)(上海晶純生化科技股份有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma)；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(凱基生物材料有限公司).

相差倒置顯微鏡(NikonT1-SM120)；752型紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；酶聯免疫檢測儀(Biorad)；熒光顯微鏡(LeicaZEISS HAL 100).

1.2細胞培養

人鼻咽癌細胞CNE-2貼壁培養于含10%滅活胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養基中，于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件的細胞培養箱中培養.當細胞貼壁生長到鋪滿培養容器底部90%以上，進行細胞傳代.細胞傳代以PBS洗滌細胞，0.25%胰蛋白酶消化細胞，2～3 d傳代一次，細胞傳代7次內取對數生長期且狀態良好的細胞進行實驗.

1.3GSNO的合成與定量

GSNO不穩定，一般采取現配現用的方式[17]，采用GSH和NaNO2在酸性避光條件下反應合成.

合成：400 mmol/L GSH 0.4 mL，加入200 mmol/L HCL 0.2 mL，然后加入400 mmol/L NaNO20.2 mL，混合避光室溫反應15 min，加入40%NaOH(約3～4 μL), 調整pH=7.2，避光保存于冰浴上.

定量：利用分光光度計定量.以蒸餾水調零，將合成的產物稀釋200倍后，測定在334 nm處的吸光度值.所得的吸光度值與摩爾吸光系數0.767相比，然后乘以稀釋倍數，即求得合成的GSNO的濃度.

1.4MTT法檢測GSNO對CNE-2細胞增殖的影響

收集對數生長期的細胞接種于96孔培養板中，每孔含1.0×104個細胞.培養過夜后，分別用50、100、200、400、800 μmol/L GSNO處理12、24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃，5%CO2及飽和濕度的條件下繼續培養4 h，每孔加入MTT裂解液 (10%SDS，5%異丁醇，0.012 mmol/L HCL)100 μL，37 ℃，5%CO2及飽和濕度的條件下放置過夜后，用Biorad酶標儀在570 nm波長處測量各孔吸收值，調零孔則用RPMI-1640培養液代替細胞懸液和藥液.每次實驗3個復孔，獨立實驗重復3次.細胞生長抑制率按下列公式計算：

進行NO干預試劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)5 mmol/L(NAC用RPMI-1640溶液溶解稀釋)對GSNO作用的影響檢測時，傳代細胞貼壁生長到鋪滿培養容器底部80%左右，預先加入干擾試劑NAC，37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下孵育30 min，再加入GSNO(200 μmol/L)繼續培養24 h，再用MTT法檢測對細胞增殖的影響.

1.5形態學觀察

將蓋玻片用75%乙醇浸泡后，PBS沖洗2遍，10%胎牛血清的RPMI-1640培養液沖洗一遍后，放置于6孔板中.收集對數生長期CNE-2細胞接種于6孔培養板中，每孔含4×105個細胞.培養過夜，待貼壁生長到鋪滿培養容器底部80%左右后，200 μmol/L GSNO 作用12 h，對照組加入同體積的RPMI-1640培養液.取出細胞爬片置于載玻片上，置倒置顯微鏡下觀察，照相并記錄實驗結果.

吸去培養液，用4%多聚甲醛固定，PBST(含0.1%Tween-20，0.5%Triton100的PBS)洗滌，再加入Hochest 33342室溫暗處理20 min，用PBST洗滌.封片再置于熒光顯微鏡下觀察.激發波長350 nm，發射波長460 nm.

1.6統計學方法

2結果

2.1MTT法檢測GSNO對CNE-2細胞增殖的影響

2.1.1不同濃度GSNO處理不同時間對CNE-2細胞增殖的影響

通過使用不同終濃度的GSNO作用于CNE-2細胞，分別處理12、24 h后，結果表明，GSNO可明顯抑制CNE-2細胞的生長增殖，其效果與作用時間和濃度相關(圖1).同一作用時間內，GSNO處理24 h，對細胞生長的抑制率隨GSNO劑量的增加而上升(P<0.05)；200 μmol/L GSNO作用CNE-2細胞，12 h抑制率為19.1%，24 h抑制率為30.4%，呈時間梯度變化.

2.1.2NO清除劑對GSNO處理的CNE-2細胞增殖的影響

通過將CNE-2細胞分別用GSNO(200 μmol/L)，N-乙酰半胱氨酸(NO清除劑，5 mmol/L)及N-乙酰半胱氨酸5 mmol/L+GSNO 200 μmol/L 聯合處理24 h，檢測對CNE-2細胞增殖的影響.結果如圖2所示：單獨的N-乙酰半胱氨酸組對CNE-2細胞的生長抑制率明顯低于GSNO組(P<0.05)，與對照組相比沒有明顯的區別(P>0.05).N-乙酰半胱氨酸+GSNO組對CNE-2細胞的生長抑制率低于GSNO組(P<0.05)，表明NAC預處理減弱了GSNO對CNE-2細胞的生長抑制效應.

圖1　GSNO對CNE-2細胞增殖的抑制作用Fig. 1　Inhibitory effect of GSNO on the proliferation of CNE-2 cells

圖2　NO清除劑對GNSO處理的CNE-2細胞生長增殖的影響Fig. 2　Effect of NO scavenger on the proliferation of CNE-2 cells treated with GNSO

2.2GSNO作用于CNE-2細胞的形態學觀察

2.2.1倒置顯微鏡觀察

在倒置顯微鏡下，對照組CNE-2細胞貼壁生長，形態呈現不規則多邊形，細胞生長密集，相鄰細胞緊密連接成片；200 μmol/L GSNO作用12 h后的CNE-2細胞，各細胞間接觸性下降，細胞分布變得稀疏，細胞形態開始由多邊形變為圓形，部分細胞外圍出現一層小泡，細胞核初步聚集，細胞胞漿逐漸濃縮(圖3).

圖3　倒置顯微鏡觀察GSNO處理的CNE-2細胞的形態學改變Fig. 3　Morphological changes of CNE-2 cells treated by GSNO were observed by electron microscope

2.2.2熒光顯微鏡觀察

Hoechst 33342是一種可以穿透細胞膜，嵌入細胞核雙鏈DNA的細胞核藍色熒光染料，對細胞的毒性較低.結果(圖4)顯示:對照組CNE-2細胞的細胞核呈藍色；200 μmol/L GSNO作用12 h后的CNE-2細胞，細胞質發生固縮，細胞核致密開始出現濃縮，細胞核顏色開始由藍色變為亮藍色.

圖4　熒光顯微鏡觀察GSNO處理的CNE-2細胞的形態學改變Fig. 4　Fluorescence microscopy was used to observe the morphological changes of CNE-2 cells treated with GSNO

3討論

目前臨床采用化學藥物治療鼻咽癌雖取得了一定的進展，但在提高遠期治療效果、降低毒副反應和提高鼻咽癌患者生存質量方面還需做很大努力，因此需要尋找更為精確有效的鼻咽癌治療藥物及治療靶點[18].

已有資料表明，NO可抑制包括腫瘤細胞在內的多種細胞生長增殖，并誘導細胞凋亡.張新宇等[19]通過將不同濃度的NO供體硝普鈉(Sodium Nitroprusside，SNP)作用于體外培養的骨肉瘤細胞株(HOS)，結果表明200 μmol/L SNP對HOS細胞生長有明顯抑制作用.蔣雪梅等[20]通過對人肝癌細胞SMMC-7721和HepG2的研究，發現NO可抑制人肝癌細胞生長增殖，誘導細胞凋亡及死亡.余紅民等[21]研究發現GSNO能促使人肺腺癌A549細胞凋亡，并進一步發現其作用機制可能與巰基亞硝基化修飾作用有關.

蛋白質巰基亞硝基化修飾是指NO對蛋白質半胱氨酸巰基共價修飾，將蛋白質半胱氨酸巰基(-SH)轉化為巰亞硝基(-SNO)的過程，是一種依賴NO的巰基氧化修飾，包括NO對蛋白質半胱氨酸巰基的直接亞硝基化和利用中間產物進行的轉亞硝基化兩種方式.在細胞中，轉亞硝基化的方式更為普遍[22].GSNO作為一種低分子量的巰基亞硝基化合物，它比NO穩定也更加方便NO發揮其生物活性.在轉亞硝基化途徑中，GSNO可作為其中間產物將NO反式轉移到蛋白質半胱氨酸巰基(Cys-SH)上，發生轉亞硝基化作用，接著參與后續調控.研究表明，蛋白質巰基亞硝基化產物在多種疾病中表現出升高或降低異常，蛋白質巰基亞硝基化調控有可能成為腫瘤治療的一個新途徑[23].

本研究將不同濃度的GSNO作用于人鼻咽癌CNE-2細胞，結果表明：NO能明顯抑制CNE-2細胞增殖，200 μmol/L GSNO作用CNE-2細胞，12 h抑制率為19.1%，24 h抑制率為30.4%，呈時間梯度變化.在一定濃度范圍內，GSNO抑制CNE-2細胞的生長增殖效果與作用時間和濃度相關.CNE-2細胞經200 μmol/L GSNO作用12 h后，細胞形態開始發生變化，細胞開始變圓，細胞分布變得松散，部分細胞周邊出現一層小泡.經Hoechst 33342染色后，細胞核致密開始出現濃縮.

綜上所述，本文研究結果表明GSNO能明顯抑制人鼻咽癌細胞的增殖，在一定濃度范圍內，作用效果與時間和濃度相關.這一研究結果為臨床治療鼻咽癌提供了一個新的思路，而NO相關的作用機理還需進一步的研究.

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收稿日期：2016-03-03

基金項目：浙江省自然科學基金項目(LQ13H310005)；杭州師范大學本科生創新能力提升工程項目(CX2014085).

通信作者：劉姬艷(1979—)，女，副教授，博士，主要從事細胞生物學研究.E-mail: liujiyan_grace@163.com

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2016.04.008

中圖分類號:R282.71

文獻標志碼:A

文章編號:1674-232X(2016)04-0377-05

Effects of GSNO on the Proliferation of Human Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line

ZHAN Ya, WANG Shuqi, HE Shasha, WANG Ying, LIU Jiyan

(College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Abstract:GSNO was synthesized by the reaction of GSH and NaNO2 under the condition of acid shelter, the effects of GSNO on the proliferation of CNE-2 cells were studied with the constructed human nasopharyngeal carcinoma cell line as a model. The results showed that NO could obviously inhibit the proliferation of CNE-2 cells, 200 μmol/L GSNO CNE-2 cells, 12 h inhibition rate was 19.1 %, 24 h inhibition rate was 30.4 %. In a certain concentration range, the inhibition of GSNO on the growth of CNE-2 cell proliferation effect related to the reaction time and concentration.

Key words:GSNO； Human nasopharyngeal carcinoma cell line； MTT detection method