丹蔞片對同型半胱氨酸誘導的兔主動脈內皮細胞CHOP、BIP蛋白表達和凋亡的影響*

張　妍,史占江,牛春玲,沈曉君

河南中醫藥大學基礎醫學院病理與病理生理學學科 鄭州 450046

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丹蔞片對同型半胱氨酸誘導的兔主動脈內皮細胞CHOP、BIP蛋白表達和凋亡的影響*

張妍,史占江,牛春玲,沈曉君#

河南中醫藥大學基礎醫學院病理與病理生理學學科 鄭州 450046

摘要目的：觀察丹蔞片對同型半胱氨酸(HCY)誘導的兔主動脈內皮細胞凋亡及內質網應激相關蛋白C/EBP 環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白(CHOP)、免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BIP)表達的影響。方法：以 HCY誘導建立兔主動脈內皮細胞損傷模型，分別用瑞舒伐他汀(他汀)、丹蔞片含藥血清或二者聯合共同培養48 h后，Annexin V-PI法檢測細胞凋亡率，Western blot法檢測CHOP、BIP蛋白表達情況。以未誘導細胞作空白對照。結果：模型細胞凋亡率及BIP、CHOP蛋白表達水平均高于空白對照(P<0.05)。丹蔞片和他汀可明顯降低模型細胞的凋亡率，二者具有協同作用(F丹蔞片=475.288,F他汀=235.248,F交互=121.377,P<0.05)；丹蔞片可顯著下調模型細胞BIP、CHOP蛋白的表達水平，與他汀無協同作用(F丹蔞片=7.017,8.147,P均<0.05；F交互=0.590,1.406,P均>0.05)。結論：丹蔞片可通過下調CHOP、BIP的表達抑制血管內皮細胞凋亡。

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發病原因復雜多變。研究[1-2]證實，與冠狀動脈疾病、腦血管病存在明顯相關性的高同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)血癥是AS的一個獨立危險因素。HCY可造成血管內脂質堆積、內皮細胞損傷、巨噬細胞吞噬和平滑肌細胞增殖，大量堆積的游離脂質損傷內質網，導致內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[3-4]，從而引起AS斑塊的形成和破裂。ERS可通過未折疊蛋白質應答(unfolded protein response，UPR)激活 C/EBP 環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)，因而CHOP被視為ERS的標志之一[5]。同樣ERS發生時免疫球蛋白重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chains binding protein，BIP)的表達也升高[6]。作者體外培養并用HCY誘導兔主動脈內皮細胞, 制備血管內皮細胞損傷模型觀察在防治心腦血管疾病藥物丹蔞片和對照藥物瑞舒伐他汀作用下，模型細胞凋亡情況及BIP、CHOP的表達水平，為丹蔞片抗 AS 藥理學作用的研究提供實驗數據和理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物雄性普通級健康新西蘭大耳白兔, 6月齡，體重2.0～2.3 kg,由河南康達實驗動物有限公司提供,動物合格證號SCXK(豫)2010-0001。

1.1.2藥品和試劑丹蔞片購自吉林康乃爾藥業有限公司,批號20130305;瑞舒伐他汀(他汀)購自阿斯利康制藥有限公司,批號125621;HCY、β-actin為Sigma公司產品; Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司；FITC標記二抗為Abcam公司產品；BIP，批號3158-2, 相對分子質量78 000,北京前景科創生物公司產品;CHOP(GADD153),批號bs-1362R,相對分子質量27 000,北京博奧森生物公司產品;兔主動脈內皮細胞購自美國San Diego 細胞應用公司。

1.1.3主要儀器CO2恒溫培養箱，日本 Sanyo 公司產品；FACSCalibur型流式細胞儀，BD公司產品；FLUOVIEW FV100共聚焦熒光顯微鏡，德國萊卡儀器有限公司產品；JY-SCZ蛋白垂直電泳儀，北京東方電泳設備有限公司產品；DYCZ-40D轉膜儀，北京六一儀器廠產品；Alpha Imager 2200紫外線成像儀，美國Alpha Innotech公司產品。

1.2含藥血清的制備以5倍的臨床劑量對兔用藥，每日分2次灌胃，持續5 d，最后一次給藥后1 h，從腹主動脈中抽取全血，離心取血清層備用。

1.3實驗分組將兔主動脈內皮細胞稀釋至1×108L-1后，接種在含胎牛血清的DMEM 培養基中，繼續培養后將細胞分為空白對照組、模型組、他汀組、丹蔞片組、他汀+丹蔞片組，每組6個復孔。除空白組外，其余組均加入適量終濃度為10-4mol/L 的HCY誘導24 h，然后他汀組、丹蔞片組、他汀+丹蔞片組分別加入相應的含藥血清，培養48 h后收集細胞。

1.4觀察指標

1.4.1Annexin V-PI方法檢測細胞凋亡率用PBS洗滌收集的細胞，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，收集轉移，吹打混勻，1 000 r/min 4 ℃離心 10 min，棄上清，加入冷 PBS 1 mL，輕輕振蕩使細胞懸浮，調整細胞密度至1×106mL-1，取0.5 mL細胞懸液，1 000 r/min 4 ℃離心3 min，棄上清，將細胞重懸于200 μL Binding Buffer,加入Annexin V-FITC 10 μL和 PI 5 μL，輕輕混勻，避光室溫反應15 min,加入Binding Buffer 300 μL，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5統計學處理采用SPSS 19.0分析，模型組和空白對照組間各指標的比較采用兩獨立樣本t檢驗， 采用析因設計的方差分析評判丹蔞片和他汀對模型細胞凋亡、CHOP和BIP蛋白表達的影響，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1細胞凋亡檢測結果模型組細胞凋亡率為(14.113±0.744)%，高于空白對照組的(0.367±0.350)%(t=40.937，P<0.001)，提示HCY可導致兔主動脈內皮細胞凋亡。他汀、丹蔞片均可顯著抑制模型細胞凋亡，二者聯合抑制作用更強(表1)。

表1　丹蔞片和他汀對模型誘導細胞凋亡率的影響(n=6)　%

F丹蔞片=475.288，F他汀=235.248，F交互=121.377，P<0.001。

2.2BIP、CHOP 蛋白表達檢測結果見圖1，表2、3、4。表2提示，HCY誘導的兔主動脈內皮細胞(模型組)BIP、CHOP表達較空白對照組升高。表3、表4提示，丹蔞片可顯著降低模型細胞BIP、CHOP的表達，他汀可顯著降低BIP的表達；二者對降低BIP、CHOP的表達無協同作用。

1：空白對照組； 2：模型組；3：他汀組； 4：丹蔞片組； 5：他汀+丹蔞片組。 圖1　Western blot檢測細胞中BIP、CHOP蛋白的表達

組別nBIPCHOP空白對照組60.350±0.3200.547±0.374模型組61.473±0.4291.393±0.763t5.1402.439P<0.0010.035

表3　丹蔞片和他汀對模型細胞BIP表達的影響(n=6)

F丹蔞片=7.017，P=0.015;F他汀=5.777，P=0.026;F交互=0.590，P=0.452。

表4　丹蔞片和他汀對模型細胞CHOP表達的影響(n=6)

F丹蔞片=8.147，P=0.010;F他汀=3.092，P=0.094;F交互=1.406，P=0.250。

3討論

AS及其所導致的心腦血管疾病是當今人類死亡的首位原因[7]，其確切的病因至今尚未完全闡明，因此，AS發生機制及治療靶點成為目前研究的熱點[8]。

研究[9]證實HCY誘導ERS引起的血管內皮細胞凋亡是AS發生的關鍵性環節。內質網是細胞內蛋白質合成折疊、脂質合成和Ca2+儲存的主要位置。HCY是AC發生的獨立危險因子，HCY所含的巰基作為還原性物質可改變內質網內的氧化還原狀態，使大量未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網中蓄積，進而使內質網穩態失衡，引起應激反應，稱為ERS[10]。BIP(GRP78)是內質網的一種分子伴侶，在輔助蛋白質折疊、穩定內質網中Ca2+水平、調節ERS跨膜信號感受器活性方面發揮重要功能，顯示出細胞保護的潛在作用[11]。ERS早期，BIP表達迅速增加，可幫助變性蛋白重新折疊, 恢復蛋白質的正確構象，緩解ERS；當ERS持續時間過長、內質網功能失衡時, 大量促凋亡蛋白被激活，誘導ERS反應性細胞凋亡。CHOP也是 ERS 特異性促凋亡因子，研究[12]發現ERS 通過 UPR激活 CHOP，CHOP還可被ERS的各種刺激因素所激活。故BIP、CHOP可反映內質網應激狀態。

丹蔞片由瓜蔞皮、澤瀉、葛根、丹參、黃芪、赤芍等組成，具有活血化瘀、寬胸通陽、益氣通脈、化痰散結之作用，在心腦血管疾病的預防和治療中作用顯著。該研究結果顯示， HCY可以明顯促進兔主動脈內皮細胞凋亡，BIP、CHOP表達顯著升高，證實HCY誘導ERS引起的血管內皮細胞凋亡參與了AS的發生；丹蔞片對HCY誘導的血管內皮細胞凋亡具有抑制作用，且與他汀可協同用藥；丹蔞片可降低HCY誘導的兔主動脈內皮細胞中BIP、CHOP蛋白的表達。該研究結果提示丹蔞片可通過下調BIP、CHOP蛋白表達抑制血管內皮細胞凋亡，其可與他汀協同作用，發揮抗AS作用。

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(2015-09-11收稿責任編輯王曼)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.007

#通信作者，女，1955年5月生，碩士，教授，研究方向：心血管疾病的中醫藥防治，E-mail:shenxiaojun0628@163.com

中圖分類號R543.5

關鍵詞丹蔞片；C/EBP環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白；免疫球蛋白重鏈結合蛋白；血管內皮細胞；凋亡；兔

Effect of Danlou tablet on CHOP,BIP protein expressions and apoptosis of rabbit aortic endothelial cells

ZHANG Yan,SHI Zhanjiang, NIU Chunling, SHEN Xiaojun

DisciplineofPathologyandPathophysiology,BasicMedicalCollege，HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046

Key wordsDanlou tablet;C/EBP-homologous protein;immunoglobulin heavy chains binding protein;vascular endothelial cell;apoptosis;rabbit

AbstractAim: To study the effect of Danlou tablets on the apoptosis of rabbit aortic endothelial cells induced by homocysteine(HCY) and the expressions of endoplasmic reticulum stress related proteins C/EBP-homologous protein(CHOP) and immunoglobulin heavy chains binding protein(BIP). Methods: There were 5 groups. The blank group: aortic endothelial cells were not induced by HCY; the model group: aortic endothelial cells were induced by HCY; Danlou group, rosuvastatin group and combination group: aortic endothelial cells were induced by HCY and then cultured for 48 hours by serum containing Danlou tablet, rosuvastatin or rosuvastatin and Danlou tablet, respectively. Apoptosis rate and expressions of CHOP and BIP protein were detected by Annexin V-PI and Western blot. Results: Compared with blank group, apoptosis rate, the expressions of CHOP and BIP protein in model group increased significantly(P<0.05). Both Danlou tablet and rosuvastatin could decrease apoptosis rate of cells with HCY induction, and there was synergistic effect between them(FDanlou tablets=475.288，Frosuvastatin=235.248，Finteraction=121.377，P<0.05). Danlou tablet could decrease the expressions of BIP and CHOP protein(FDanlou tablets=7.017，8.147, P<0.05), but had no synergy with rosuvastatin(Finteraction=0.590,1.406，P>0.05).Conclusion: Danlou tablet could inhibit the apoptosis of vascular endothelial cells by down-regulating the expressions of CHOP and BIP protein.

*國家自然科學基金資助項目81273949；河南省基礎與前沿技術研究項目072300450030；河南省教育廳科學技術研究重點項目13A310612；河南中醫藥大學科研苗圃工程MP2015-10