4.1R基因敲除小鼠血液生理生化參數分析*

禹麗娜,李建輝，張麗果，寧姝威，薛超越，范丹丹，楊小靜，裘一兵，康巧珍，汲振余#

1)河南省醫藥科學研究院腫瘤病理科 鄭州 450052　2)鄭州市中心醫院消化內科 鄭州 450000　3)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

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4.1R基因敲除小鼠血液生理生化參數分析*

禹麗娜1,2),李建輝1,3)，張麗果1)，寧姝威1,3)，薛超越1,3)，范丹丹1)，楊小靜1)，裘一兵1)，康巧珍3)，汲振余1)#

1)河南省醫藥科學研究院腫瘤病理科 鄭州 4500522)鄭州市中心醫院消化內科 鄭州 4500003)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

摘要目的：檢測并分析蛋白4.1R基因敲除小鼠(4.1R-/-)和野生型小鼠(4.1R+/+)血液生理生化參數。方法：摘眼球法采集兩組小鼠(n=6)血液，用全自動血液細胞分析儀和生化分析儀檢測血液生理生化參數。結果：血液生理參數中，4.1R-/-小鼠紅細胞計數、血紅蛋白、紅細胞壓積和中性粒細胞比率顯著低于野生型小鼠(P<0.05)；血小板計數、平均血小板體積、血小板壓積、白細胞計數、淋巴細胞比率顯著高于野生型小鼠(P<0.05)。生化參數中，4.1R-/-小鼠堿性磷酸酶顯著低于野生型小鼠，總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素顯著高于野生型小鼠(P<0.05)。結論：蛋白4.1R缺失可導致慢性溶血性貧血，4.1R-/-小鼠相關血液生理生化參數隨之改變。

蛋白4.1R是最初發現于成熟紅細胞中的細胞膜骨架蛋白分子，是紅細胞膜骨架的一個基本成分[1]，有相對分子質量為80 000、135 000兩種亞型[2]。目前，該蛋白在紅細胞中的功能研究比較透徹，但在有核細胞中的功能還不清楚。4.1R蛋白缺乏會降低有核細胞E-鈣黏蛋白與肌動蛋白細胞骨架的結合能力并破壞細胞與細胞之間的接觸[3]，影響角質細胞的擴散和遷移[4]。CD4+T淋巴細胞中4.1R蛋白能與L型氨基酸轉運體(L-type amino acid transporter,LAT)結合并抑制ZAP-70對LAT的磷酸化，負調控CD4+T淋巴細胞的活化[5]。為進一步研究蛋白4.1R在T細胞中的功能，作者從美國紐約血液中心引進并建立了4.1R基因敲除(4.1R-/-)小鼠模型，對其血液生理和生化參數進行了測定，以豐富4.1R-/-小鼠模型相關資料，為后續研究與應用提供基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物4.1R-/-小鼠與4.1R+/+野生型小鼠，遺傳背景為C57BL/6，SPF級，均來自該實驗室。小鼠按SPF級標準飼養于IVC-Ⅱ型獨立送風隔離籠具中。環境溫度20～25 ℃，濕度40%～60%，照明12 h亮暗交替，空氣潔凈度1萬級。飲水為經高溫高壓蒸汽滅菌的蒸餾水，飼料為河南省實驗動物中心提供的經鈷60照射滅菌的SPF級飼料。

1.2小鼠基因型鑒定隨機選取8周齡4.1R-/-小鼠與4.1R+/+小鼠各6只，取肝臟，研磨提取RNA反轉錄(42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min)，之后進行PCR擴增，反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸2 min，30個循環。4.1R引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，正向引物1序列：5’-ATGACAACAGAGAAGAGTTTAGTG GCTGAAGC-3’，正向引物2序列：5’-ATGCACTGTA AGGTCTCCTTGTTGGATGACACG-3’，共同反向引物序列：5’-CTCCTCAGAGATCTCTGTCTCCTGGTGGA-3’。產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增出1 700 bp與2 500 bp片段的為4.1R+/+小鼠，無擴增片段的為4.1R-/-小鼠。

1.3血液生理參數檢測取8周齡 4.1R-/-小鼠與4.1R+/+小鼠各6只，空腹12 h，摘除眼球法取血，每只取血0.8 mL左右，裝入2 mL加有抗凝劑的采血管中，使用全自動血液分析儀(Pentra80，法國ABX公司)檢測血液生理參數[6]。

1.4生化參數檢測取8周齡4.1R-/-小鼠與4.1R+/+小鼠各6只，空腹12 h，摘除眼球法取血，每只取血0.8 mL左右，收集入未加抗凝劑的采血管中，室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，分離血清。使用全自動生化分析儀(BT2000Plus，意大利)檢測血液生化參數[7]。

1.5統計學處理采用SPSS 19.0進行統計分析，兩組小鼠血液生理生化參數的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1小鼠基因型鑒定PCR擴增后，4.1R+/+小鼠成功擴增出2條條帶，大小分別為1 700 bp與2 500 bp，而4.1R-/-小鼠沒有擴增出相應條帶，表現為完全缺失(圖1)。

2.2兩組小鼠血液生理參數的比較見表1。4.1R-/-小鼠紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞壓積(HCT)和中性粒細胞比率(NEU)低于4.1R+/+小鼠(P<0.01)，而血小板計數(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)、白細胞計數(WBC)和淋巴細胞比率(LYM)高于4.1R+/+小鼠(P<0.05)。二者的單核細胞比率(MON)、嗜酸性粒細胞比率(EOS)、嗜堿性粒細胞比率(BAS)、異淋巴細胞百分比(ALY)、巨大不成熟細胞百分比(LIC)差異無統計學意義。

表1　兩組小鼠血液生理參數的比較

2.3兩組小鼠血液生化參數的比較見表2。4.1R-/-小鼠堿性磷酸酶(ALP)水平低于4.1R+/+小鼠(P<0.05)；總膽紅素(T-BIL)、直接膽紅素(D-BIL)和間接膽紅素(I-BIL)水平高于4.1R+/+小鼠(P<0.05)。二者的谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)差異無統計學意義。

表2　兩組小鼠血液生化參數的比較

3討論

蛋白4.1R在紅細胞膜上一端連接跨膜蛋白，一端連接血影蛋白-肌動蛋白骨架，對維持紅細胞的形狀、黏附、脆性及正常生理功能具有重要作用[8]。4.1R基因敲除會引起紅細胞的畸形以及溶血[9-10]。蛋白4.1R缺失會導致人類紅細胞呈橢圓形，而4.1R-/-小鼠紅細胞更多地呈現為球形[11]。該實驗中作者對實驗小鼠的基因型進行了鑒定，確定了小鼠的基因型，4.1R-/-小鼠具有穩定的遺傳特性。作者在400倍顯微鏡下觀察，并未發現4.1R+/+小鼠與4.1R-/-小鼠血涂片有異常。小鼠血液生理生化參數檢測結果顯示，4.1R-/-小鼠血液中HGB水平低于4.1R+/+小鼠。一般來說，動物血液中HGB含量越多，紅細胞最大脆性越小[12]。因此，4.1R-/-小鼠紅細胞最大脆性大于4.1R+/+小鼠，相應地其抗張力和變形能力降低，故具有易溶血傾向。變形能力差的紅細胞不易或不能通過直徑比它小很多的脾竇微循環，而阻留在脾臟內，被巨噬細胞破壞。肝臟也可清除改變顯著的異常紅細胞。較大量血管外溶血時，膽紅素與葡萄糖醛酸不能及時結合，血液中I-BIL含量升高，可能會出現黃疸。在小鼠血液生化參數檢測中發現，4.1R-/-小鼠血液中I-BIL含量偏高。據此判斷，蛋白4.1R缺失小鼠紅細胞易出現溶血。長期的慢性溶血使得4.1R-/-小鼠發生貧血現象，造成RBC降低，HCT變小，PLT升高，肝功能指標ALP降低。

研究[11]顯示，蛋白4.1R缺失后，小鼠CD8+T淋巴細胞細胞周期縮短，增殖能力變強。該研究中，血液生化實驗檢測結果顯示4.1R-/-小鼠血液中WBC減少，其中LYM偏高，NEU偏低，此現象與蛋白4.1R在CD8+T淋巴細胞中的功能是否具有相關性還有待進一步研究。

雖然4.1R-/-小鼠易發生慢性溶血性貧血，但是在SPF飼養條件下，其與4.1R+/+小鼠相比在外觀形態、體重、日常活動等方面并無明顯差異。4.1R-/-小鼠也具有正常的生存能力和生育能力，因此是研究蛋白4.1R功能的有效動物模型。4.1R-/-小鼠血液生理生化參數指標系統的建立，為研究蛋白4.1R在紅細胞發育、T淋巴細胞功能及相關疾病中的作用提供了基礎資料。

參考文獻

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(2015-10-14收稿責任編輯王曼)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.008

#通信作者，男，1965年8月生，博士，研究員，研究方向：蛋白功能與腫瘤，E-mail:jizhenyu@zzu.edu.cn

中圖分類號R-332

關鍵詞4.1R；血液生理生化參數；溶血性貧血；小鼠

Analysis on blood physiological and biochemical parameters of 4.1R gene knockout mice

YU Lina1,2),LI Jianhui1,3)，ZHANG Liguo1)，NING Shuwei1,3)，XUE Chaoyue1,3)，FAN Dandan1),YANG Xiaojing1)，QIU Yibing1)，KANG Qiaozhen3), JI Zhenyu1)

1)DepartmentofTumorPathology,HenanInstituteofPharmaceuticalScience,Zhengzhou450052 2)DepartmentofGastroenterology,ZhengzhouCentralHospital,Zhengzhou4500003)SchoolofLifeScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordsprotein 4.1R；blood physiological and biochemical parameter；hemolytic anemia；mouse

AbstractAim: To detect and analyze blood physiological and biochemical parameters of 4.1R gene knockout mice(4.1R-/-) and wild-type (4.1R+/+) mice. Methods: Blood samples of 4.1R-/-mice and wild-type mice were collected by enucleating of eyeball, followed by blood physiological and biochemical parameters testing with automatic blood cell analyzer and biochemical analyzer. Results: Compared with those of the wild-type mice,RBC, HGB, HCT,and NEU of 4.1R-/-mice were obviously lower(P<0.05);while PLT,MPV,PCT,WBC and LYM of 4.1R-/-mice were obviously higher(P<0.05). ALP,one of biochemical parameters, was significantly lower,while T-BIL, D-BIL and I-BIL of 4.1R-/-mice were significantly higher(P<0.05). Conclusion: Deletion of protein 4.1R might result in chronic hemolytic anemia, and changes of blood physiological and biochemical parameters may be basic information for the further study with 4.1R-/-mice model.

*國家自然科學基金資助項目81172784,30972707