人臍帶間充質干細胞神經分化微環境的優化*

邢　衢，馬珊珊#，王欣欣，孟　楠，黃團結，韓　康，關方霞1,#

1)鄭州大學生命科學學院干細胞研究室 鄭州 450001　2)鄭州大學第一附屬醫院干細胞研究室 鄭州 450052

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人臍帶間充質干細胞神經分化微環境的優化*

邢衢1)，馬珊珊1)#，王欣欣2)，孟楠2)，黃團結1)，韓康1)，關方霞1,2)#

1)鄭州大學生命科學學院干細胞研究室 鄭州 4500012)鄭州大學第一附屬醫院干細胞研究室 鄭州 450052

摘要目的：探討人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)體外定向分化為神經元細胞的適宜條件，提高hUC-MSCs的分化效率，為神經細胞移植提供新細胞來源。方法：采用組織貼壁法分離培養hUC-MSCs，并應用流式細胞術鑒定其表面抗原；利用經典誘導(方案1)和復合誘導(方案2)兩種方法定向誘導hUC-MSCs分化為神經元細胞，并以只加培養基的hUC-MSCs作對照。倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，免疫細胞化學檢測神經元遷移蛋白(DCX)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)的表達，qRT-PCR檢測各組神經分化標記基因DCX、NSE、Mash、Ngn1的轉錄水平。結果：與對照組相比，兩種方案均能誘導hUC-MSCs分化為神經元樣細胞，開始表達DCX和NSE；但是，與方案1相比，方案2組的細胞NSE的陽性表達率更高(P<0.05)，各神經分化標記基因mRNA表達水平升高(P<0.05)，向神經元樣細胞分化更明顯。結論：復合誘導方案能有效改善神經分化微環境，促進hUC-MSCs定向分化為神經元樣細胞。

中樞神經系統(central nervous system,CNS)損傷易導致腦、脊部神經細胞大量死亡、神經功能永久缺失，且很難自我修復[1]。單獨或聯合其他生物材料移植干細胞均能促進變性神經元、膠質細胞再生，重塑神經環路和突觸連接，恢復傳遞功能[2]。人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)是一類采集痛苦小、自我更新快、增殖能力強、無免疫排斥、無倫理爭議的干細胞，有極大的臨床應用價值[3]。考慮到干細胞自發轉化的風險，移植向神經分化后的MSC更為安全，探討適宜的誘導分化條件或微環境成為決定MSC轉歸效率的關鍵[4]。因此，該實驗探討2種不同組分的神經誘導微環境(經典誘導和復合誘導)對hUC-MSCs定向分化為神經元樣細胞的影響，并檢測相關指標，篩選和評價優化方案，為細胞移植奠定基礎。

1材料與方法

1.1標本來源與主要試劑臍帶標本來源于鄭州大學第一附屬醫院產科足月剖宮產的健康產婦志愿者，檢測傳染性相關指標均呈陰性。研究經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準。DMEM/F12細胞培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、低糖(LG)-DMEM培養基(美國Thermo Fisher Scientific公司)，胎牛血清(美國Gemini公司)，胰蛋白酶消化液、L-谷氨酰胺(L-glutamine)、β-巰基乙醇(β-ME)、DMSO、青霉素鏈霉素混合液(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)，重組人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、丁基羥基茴香醚(BHA)、Forskolin 腺苷酸環化酶激活劑(美國Aladdin公司)，全反式維甲酸(美國Sigma公司)，氫化可的松(Hydrocortisone)、胰島素(Insulin)、氯化鉀、氯化鈉、HEPES、氯化鎂、氯化鈣、Glucose、Glycine(北京索萊寶科技有限公司)，表皮細胞生長因子(EGF)、B-27添加劑(美國Gibco公司)，抗人抗體CD29-FITC、CD31-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD90-PE(美國Biolegend公司)，鼠抗DCX單抗、兔抗NSE抗體(英國Abcam公司)，FITC標記山羊抗小鼠IgG 、FITC標記山羊抗兔IgG(中國碧云天公司)，DAPI染色液(武漢博士德生物工程有限公司)，RNA逆轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒均購自日本TaKaRa公司；引物合成由上海生工生物技術服務有限公司提供。

1.2hUC-MSCs的分離、培養在生物安全柜內，取新鮮臍帶標本兩段，每段4 cm，用預冷生理鹽水沖洗3次、去除血污、洗消干凈。剔除臍帶表面薄膜、2條動脈和1條靜脈血管后，將沃頓膠 (WJ) 組織用生理鹽水清洗干凈，剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，分散轉移到25 cm2培養瓶中，加入3 mL含有體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基，置于37 ℃、體積分數5%的CO2恒溫孵育箱內培養。3 d后更換培養基，間隔2 d換液1次。當細胞達80%～90%融合時，用胰蛋白酶消化后傳代，每間隔2 d換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察各階段細胞形態變化，并拍照記錄。

1.3hUC-MSCs細胞表面抗原檢測取P3代hUC-MSCs細胞用2.5 g/L的胰蛋白酶消化離心后，預冷的PBS潤洗、重懸為1×107mL-1的單細胞懸液，分別加入2 μL CD45-PE、CD44-FITC、CD90-PE、CD31-FITC、CD29-FITC單克隆抗體，4 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞表面抗原。

1.4hUC-MSCs的神經誘導分化取P3代對數生長期的hUC-MSCs，按預處理、分化誘導、維持誘導三階段進行實驗。①預處理階段，使用含體積分數15%胎牛血清的DMEM-LG培養1 d，加入10 μg/L bFGF繼續誘導1 d。②分化階段采用不同微環境誘導1 d。經典誘導(方案1)組采用體積分數2% DMSO、6 mmol/L β-ME、DMEM-LG；復合誘導(方案2)組采用體積分數2% DMSO、200 μmol/L BHA、10 μmol/L Forskolin、0.5 μmol/L ATRA、 5 mg/L胰島素、1 μmol/L氫化可的松、25 mmol/L KCl、130 mmol/L NaCl、10 mmol/L HEPES、1 mmol/L MgCl2、2 mmol/L CaCl2、10 mmol/L葡萄糖、0.002 mmol/L甘氨酸、DMEM-LG。③維持誘導階段，加入含10 μg/L EGF、10 μg/L bFGF、1×B-27、2 mmol/L L-谷甘氨酸的DMEM-LG處理1 d。對照組僅添加DMEM/F-12培養基。所有誘導分化試劑均須經0.22 μm針頭式過濾器除菌后使用。使用倒置顯微鏡觀察各組細胞神經分化情況，并拍照記錄。

1.5免疫熒光檢測各組細胞神經元遷移蛋白(DCX)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)的表達取狀態良好的P3 hUC-MSCs，按2×105/孔接種于放有無菌蓋玻片24孔板。匯聚度達50%時，按不同分化方案誘導完畢后，用PBS漂洗3遍，40 g/L多聚甲醛于4 ℃過夜固定。再用體積分數0.2% Triton X-100室溫通透10 min，PBS潤洗3次，每次10 min。然后加入體積分數5%BSA室溫封閉30 min后，分別加入鼠抗DCX單抗(稀釋50倍使用)、兔抗NSE抗體(稀釋70倍使用)置于4 ℃孵育過夜；同時，用PBS替代一抗作陰性對照。次日用PBS漂洗3次，每次5～10 min后，各組按200 μL/孔加入FITC標記的羊抗鼠或羊抗兔IgG(稀釋200倍使用)室溫避光孵育1 h。最后用PBS輕柔潤洗3次后，加入DAPI染色劑復染細胞核, 封片，上鏡觀察，計數。

1.6qRT-PCR檢測各組細胞神經分化相關基因(DCX、NSE、Mash、Ngn1)mRNA的表達每組細胞各取5×106個細胞，以Trizol法常規提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，GAPDH作為內參，采用qRT-PCR檢測DCX、NSE、Mash、Ngn1基因的表達情況。PCR反應條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個循環?；蛞镄蛄?、退火溫度及擴增產物大小見表1。數據分析采用比較CT法，目的基因相對表達量(RQ)=2-ΔΔCt。實驗重復3次。

表1　引物序列、退火溫度、片段長度

1.7統計學處理采用SPSS 17.0進行數據分析。各誘導組細胞的DCX、NSE陽性表達率、相關基因(DCX、NSE、Mash、Ngn1)的mRNA表達量均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1hUC-MSCs的形態變化培養7 d后，邊緣可見紡錘形細胞爬出 (圖1A)；hUC-MSCs貼壁后，多呈現梭形或多角形，迅速增殖呈散在分布、大小不等的細胞集落(圖1B)；匯合度較高時，P3 hUC-MSCs群落呈方向性、旋渦狀聚集(圖1C)。

2.2hUC-MSCs細胞表面抗原的檢測hUC-MSCs不表達CD34、CD45，表達CD29、CD44和 CD90，陽性表達率分別為(99.90±0.10)%、(61.90±1.21)%和(100.00±0.02)%。

A:原代培養7 d；B:原代培養2周；C:P3臍帶間充質細胞。圖1　不同時期hUC-MSCs的形態變化(×100)

2.3體外誘導分化后細胞的形態變化體外培養的hUC-MSCs(對照組)多為細小的梭形、致密單層，束狀、漩渦狀排列(圖2A)；采用方案1誘導4 d后，胞體收縮、兩極伸展，可見明顯的軸突結構(圖2B)；而方案2誘導分化4 d后的細胞，出現清晰的樹突結構，有類似于網狀分支的神經細胞終結形成(圖2C)。

A:對照組；B:方案1誘導4 d后；C:方案2誘導4 d后。圖2　各組hUC-MSCs的形態變化(×200)

2.4不同誘導方案中DCX、NSE蛋白的表達見圖3、表2。方案1和方案2中的hUC-MSCs經不同神經分化方案誘導4 d后，均開始表達DCX和NSE蛋白。方案1中DCX的表達較高，說明hUC-MSCs主要向神經前體細胞分化；而方案2中NSE的表達更高，說明hUC-MSCs向神經元細胞的分化更明顯。

A:對照組；B:方案1組；C:方案2組。圖3　各組DCX(1)、NSE(2)蛋白表達的免疫熒光染色(×200)

表2　各組細胞中DCX、NSE陽性細胞率比較　%

2.5各組細胞中神經分化相關基因DCX、NSE、Mash1、和Ngn1 mRNA的表達結果見表3。與對照組相比，方案1和方案2組細胞中神經分化相關基因mRNA的表達均有明顯升高；與方案1相比，方案2中NSE、Mash1、Ngn1 mRNA表達量上升，而DCX mRNA表達量降低，說明hUC-MSCs向神經元細胞的分化更明顯。

表3　各組hUC-MSCs中DCX、NSE、Mash1、Ngn1 mRNA的相對表達量

3討論

細胞分化是一種動態、可逆的程序性重調過程[5]。2002年，Woodbury等[6]首次將骨髓MSC誘導成神經元，開啟了干細胞移植治療中樞神經損傷疾病的新思路。研究[7]證明，誘導微環境可促進成神經分化基因有序表達，啟動相關通路，并直接導致MSC跨系分化。

該研究成功地分離、培養和鑒定hUC-MSCs，并證明其在兩種體外微環境誘導下均能進行神經分化，細胞形態上出現長軸突結構、局部成纖維網狀的類神經樣細胞。不過與經典誘導方法相比，采用“細胞因子+CAMP激活劑+激素+無機鹽緩沖體系”的復合誘導使hUC-MSCs向神經元樣細胞分化更明顯，其神經元標記物NSE的表達明顯高于神經前體細胞DCX的表達。作者推測這與復合微環境體系不同組分的聯合效應相關：①細胞因子bFGF可以激活PI3K/AKT信號通路，導致干細胞骨架重組、向神經分化[8]。②Forskolin能提高腺苷酸環化酶水平，激活蛋白激酶A信號通路，誘導神經樣細胞產生[9]。③適當濃度胰島素或類胰島素對模擬低糖環境、維持干細胞增殖、分化十分必要[10]，此過程或伴隨mTOR信號通路的介導。④ATRA能阻斷Notch信號通路，上調Mash、Ngn1基因表達，動員干細胞向神經元樣分化[11-12]。⑤類似腦脊液的無機鹽緩沖體系的補充與神經分化關系密切[13-14]。因此，復合誘導方案更適合hUC-MSCs向神經元樣細胞定向分化。

綜上所述，作者優化了hUC-MSCs體外成神經誘導分化的微環境條件，為細胞移植提供了新的來源。雖然證實誘導分化能夠表達神經細胞標志物，但還未就分化細胞的電生理活性、有無致瘤性、能否修復神經損傷等問題深入討論。因此，后續實驗將結合膜片鉗技術、端粒酶活性檢測、細胞移植實驗做進一步分析評價和分析。

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(2015-12-08收稿責任編輯李沛寰)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.009

#通信作者:關方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向:干細胞與再生醫學，E-mail:guanfangxia@126.com；馬珊珊，女，1984年5月生，博士，副教授，研究方向:干細胞生物學特性分析，E-mail:mashanshan84@163.com

中圖分類號R394.2

關鍵詞人臍帶間充質干細胞；神經元；誘導分化；微環境；優化

Optimization and evaluation of micro-environment about hUC-MSCs neural differentiation

XING Qu1)，MA Shanshan1)，WANG Xinxin2)，MENG Nan2)，HUANG Tuanjie1)，HAN Kang1)，GUAN Fangxia1,2)

1)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500012)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordshUC-MSC;neuron;inductive differentiation;microenvironment;optimization

AbstractAim: To optimize the culture conditions for human umbilical cord mesenchymal stem cell (hUC-MSCs) and increase the differentiation efficiency.Methods: The hUC-MSCs were isolated form human umbilical cord by tissue adherence and its surface antigens were identified by flow cytometry.Classic strategy and composite strategy were used to induce the differentiation of hUC-MSCs into neurons, and the cells were randomly allocated into three groups: control group, classic strategy group(group 1) and composite strategy group(group 2). The morphology, the DCX/NSE positive cell ratio and expressions of neuronal differentiation genes DCX, NSE, Mash and Ngn1 were analyzed by microscope, immunohistochemistry and qRT-PCR after induced for 4 d in different groups, respectively.Results: Compared with control group, the group 1 and group 2 in vitro could both induce the neural differentiation of hUC-MSCs, and the expressions of neuronal differentiation proteins DCX and NSE could be detected. Compared with group 1, composite microenvironment demonstrated a higher NSE positive ratio(P<0.05) and mRNA expressions of neural differentiation mark genes were also higher(P<0.05), leading to differentiation towards neuron-like cells more likely.Conclusion: The composite strategy could significantly improve neural differentiation microenvironment, promote hUC-MSCs differentiation towards neuron-like cells.

*國家自然科學基金資助項目81471306,U1404313；河南省科技創新人才計劃154200510008；河南省高?？萍紕撔聢F隊支持計劃15IRTSTHN022；河南省產學研合作項目142107000008

*:與對照組相比，P<0.05;#:與方案1組相比，P<0.05。

*:與對照組相比，P<0.05;#:與方案1組相比,P<0.05。