臍帶間充質干細胞聯合鹽酸多西環素對肺纖維化小鼠的早期干預效果*

楊　宇， 袁曉梅， 趙　欣,吳敏娜，高新愿，許芝山， 鐘根深#， 郭悅鵬#

1)新鄉醫學院第一附屬醫院呼吸科 衛輝 453100　2)新鄉醫學院基礎醫學院微生物教研室 新鄉 453000　3)河南省神經病學研究所生物治療實驗室 衛輝 453100

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臍帶間充質干細胞聯合鹽酸多西環素對肺纖維化小鼠的早期干預效果*

楊宇1)， 袁曉梅1)， 趙欣1),吳敏娜2)，高新愿1)，許芝山3)， 鐘根深3)#， 郭悅鵬1)#

1)新鄉醫學院第一附屬醫院呼吸科 衛輝 4531002)新鄉醫學院基礎醫學院微生物教研室 新鄉 4530003)河南省神經病學研究所生物治療實驗室 衛輝 453100

摘要目的：探討臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)聯合鹽酸多西環素對肺纖維化小鼠的早期治療效果及作用機制。方法：健康成年清潔級雌性C57BL/6小鼠40只，采用隨機數字表法分為5組(n=8):對照組(氣管內注入生理鹽水，48 h后尾靜脈注射生理鹽水)、模型組(氣管內注入博來霉素，48 h后尾靜脈注射生理鹽水)、鹽酸多西環素組(氣管內注入博來霉素，48 h后腹腔注射鹽酸多西環素，隔日注射1次，連用4次)、干細胞組(氣管內注入博來霉素，48 h后尾靜脈注射UC-MSCs)、聯合組(氣管內注射博來霉素，48 h后尾靜脈注射UC-MSCs聯合腹腔注射鹽酸多西環素，隔日注射1次，連用4次)。于造模第28天，取小鼠右肺組織行HE、Masson染色，進行肺泡炎評分及肺纖維化評分；取左肺組織測定羥脯氨酸含量。采用免疫組化法檢測MMP-9、TIMP-1蛋白的表達。結果：與模型組相比，干細胞組和鹽酸多西環素組肺泡炎及肺纖維化程度減輕，羥脯氨酸含量降低，MMP-9蛋白的表達減弱，TIMP-1蛋白的表達升高，聯合組以上指標改善最為顯著(P<0.05)。結論：早期應用UC-MSCs聯合鹽酸多西環素能夠顯著減輕小鼠肺纖維化程度，其機制可能與提高TIMP-1表達、抑制MMP-9的表達有關。

近年肺纖維化發病率呈不斷上升趨勢，目前尚無有效治療方法；肺纖維化預后不良，中位生存期一般僅為3～5 a[1]。肺纖維化的發病機制尚未完全闡明，但已有證據[2]表明，與致病因子引發細胞外基質過度降解、纖維細胞分泌過量膠原物質有關，其中MMPs為降解細胞外基質的主要因子。現有研究[3-4]證實臍帶間充質干細胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSCs)及鹽酸多西環素均具有糾正細胞外基質代謝失衡、治療肺纖維化的作用。該研究擬通過動物實驗探討UC-MSCs聯合鹽酸多西環素對肺纖維化的早期干預效果。

1材料與方法

1.1材料40只8周齡雌性清潔級C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。博來霉素(日本化藥株式會社)，鹽酸多西環素(海口奇立制藥股份有限公司)，羥脯氨酸試劑盒(南京建成科技有限公司)，兔抗人PerCP-CD34、APC-CD45、FITC-CD90、PE-CD166單克隆抗體(美國Becton Dickinson公司)，兔抗鼠MMP-9、TIMP-1抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒(上海基因科技有限公司)，改良Masson三色染色液試劑盒(北京雷根生物技術有限公司)。手術顯微鏡(上海醫用光學儀器廠)，超凈工作臺、離心機、倒置相差顯微鏡及其他常用試劑由河南省神經病學研究所提供。臍帶取自新鄉醫學院第一附屬醫院婦產科健康足月順產新生兒。研究經該院倫理委員會批準，產婦及家屬簽署知情同意書。

1.2UC-MSCs的制備、分離與鑒定剪取5 cm新鮮臍帶，清洗后用解剖剪剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，放入培養瓶中，加入含體積分數10%胎牛血清的DMEM/F12，置于37 ℃、體積分數5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。靜止培養7 d后可見長梭形細胞從組織塊下方長出，以后每3 d換液1次。第11天，當組織塊周圍細胞團較密集時，丟棄組織塊，加入12.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化，離心后以PBS洗3遍，最后在PBS中吹打懸勻，制成1×109L-1的細胞懸液，分5管，除空白管外，向各實驗管分別加入PerCP-CD34、APC-CD45、FITC-CD90、PE-CD166標記抗體進行免疫反應，暗室內孵育30 min后PBS洗2遍，再加入PBS重懸，上流式細胞儀檢測。

1.3實驗分組與標本收集40只小鼠采用隨機數字表法分為5組(n=8):對照組(A組)、模型組(B組)、鹽酸多西環素組(C組)、干細胞組(D組)、聯合組(E組)。小鼠用體積分數10%水合氯醛按5 mL/kg腹腔內注射麻醉，取仰臥位固定于手術臺上。頸部皮膚備皮，消毒后在手術顯微鏡下縱向切開皮膚0.5 cm，鈍性分離肌肉，暴露氣管。手術顯微鏡下用1 mL注射器向A組小鼠氣管內注入100 μL生理鹽水，其他4組注射相同體積的博來霉素溶液(3.5 mg/kg)。拔出針頭后，立即將操作臺直立，左右旋轉1 min。造模后48 h，A、B組小鼠由尾靜脈注入生理鹽水200 μL；C組腹腔注入200 μL(20 mg/kg)鹽酸多西環素，隔日注射1次，連用4次；D組尾靜脈注入UC-MSCs 200 μL(約含細胞數1×106)；E組尾靜脈注入UC-MSCs，腹腔注入鹽酸多西環素，用法用量同上。于造模后第28天，麻醉小鼠，固定于手術臺上，胸部開口，剪斷胸骨，用生理鹽水灌洗肺部，摘取肺臟。取右肺放入40 g/L多聚甲醛中固定，制作石蠟切片，左肺凍存于-20 ℃備用。

1.4肺組織病理學評分對石蠟切片行HE染色、Masson染色，在光鏡下參考Szapiel等[5]提供的方法(表1)，根據HE染色評價肺泡炎程度，根據Masson染色評價肺纖維化程度。

表1　小鼠肺泡炎與肺纖維化評分標準

1.5肺組織羥脯氨酸含量的測定取60 mg凍存肺組織，采用堿性水解法測定肺組織中羥脯氨酸含量，操作步驟按羥脯氨酸試劑盒說明書進行。羥脯氨酸含量=(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度)×標準管含量(5 mg/L)×水解液總體積(10 mL)/肺組織濕重(mg)。

1.6肺組織中MMP-9、TIMP-1蛋白表達水平的測定取各組小鼠肺組織石蠟切片，按照免疫組化試劑盒操作步驟進行，染色封片后在顯微鏡下觀察，每張切片選取5個視野(×200)。細胞中出現棕黃色顆粒為陽性反應。評分:未著色為0分，輕度著色為1分，中度著色為2分，高度著色為3分。

1.7統計學處理選用SPSS 19.0處理數據。采用單因素方差分析比較5組小鼠病理學評分、肺組織羥脯氨酸含量以及肺組織中MMP-9 和TIMP-1蛋白的表達水平，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1UC-MSCs的鑒定檢測發現，實驗管細胞CD166(陽性百分比為94.52%)、CD90(陽性百分比為97.84%)高表達，CD45(陽性百分比為0.22%)、CD34(陽性百分比為0.08%)低表達。

2.2病理觀察結果見圖1。HE染色:鏡下可見A組小鼠肺泡結構完整，肺泡間隔未見增厚，偶見炎性細胞滲出；B組正常肺泡結構消失,大量炎性細胞浸潤；C組肺泡結構紊亂，肺泡間隔增寬，肺泡腔內可見中等炎性細胞浸潤；D組大部分肺泡結構正常，肺泡間隔增厚，偶見肺泡壁塌陷，近支氣管周圍炎性細胞浸潤；E組僅近胸膜處有炎性浸潤，少量肺泡間隔稍增厚，絕大部分肺泡結構正常。Masson 染色：A組肺泡間隔內見淡藍色壁狀膠原染色，為正常肺泡成分；B組滿視野藍色膠原纖維滲出；C組肺泡結構紊亂區域見大量藍色條索狀膠原纖維滲出；D組少數肺泡腔內見片狀藍色膠原纖維滲出；E組僅近胸膜處見少量藍色膠原纖維滲出。各組肺泡炎和纖維化評分見表2，由表2可知，模型組(B組)肺泡炎和肺纖維化程度最嚴重，而給予鹽酸多西環素(C組)和干細胞(D組)后均減輕，2藥聯合(E組)則最輕。

2.3肺組織中羥脯氨酸含量比較各組肺組織羥脯氨酸含量均存在統計學差異，見表2。

2.4各組小鼠肺組織中MMP-9 和TIMP-1蛋白的表達情況見圖1、表3。

表2　5組小鼠病理學評分及肺組織羥脯氨酸含量

從左至右：分別為A、B、C、D、E組;1:HE染色；2: Masson 染色；3:MMP-9；4：TIMP-1。圖1　5組小鼠HE、Masson及免疫組化染色結果(×200)

組別nMMP-9TIMP-1A組80.63±0.35*1.10±0.19*B組82.63±0.250.58±0.17C組81.63±0.35*0.70±0.19D組81.60±0.47*2.05±0.21*△E組80.88±0.28*△#2.15±0.18*△F40.911129.427P<0.001<0.001

3討論

目前構建小鼠肺纖維化模型的常用方法為肉眼下頸部切開，分離氣管后用1 mL注射器將博來霉素注入小鼠氣管內[6]。作者在造模過程中發現此種造模方式對小鼠損傷較大，易損傷頸部血管，造成小鼠失血休克死亡，同時用注射器穿刺氣管時易穿透氣管，造成藥液外滲，導致造模效果不佳。作者將此種造模方式改良，在手術顯微鏡下操作，有效避開頸部血管，手術顯微鏡下可清晰尋找到氣管軟骨間隙，確保博來霉素溶液準確灌入氣管內,造模效果均一。

臨床常用治療肺纖維化的藥物有糖皮質激素、免疫抑制劑、秋水仙堿等，此類藥物可阻止過度免疫反應，緩解患者癥狀，但并未改善患者的生存率及肺功能，且副作用大[7]。現今肺纖維化新型藥物的研發重點已從抗機體炎癥反應轉移到抗細胞外基質的成纖維化。抑制生物因子活性的抗肺纖維化藥物已逐漸應用于臨床，如生長因子TGF-β抑制劑、吡非尼酮、尼達尼布等[8]。但這些生物因子抑制劑作用靶點過于單一，不能很好地抑制由多種細胞及細胞因子交互作用產生的細胞外基質過度纖維化，且臨床應用時間尚短，療效及相關副作用有待時間考證。

近年在實驗室研究中間充質干細胞治療肺纖維化顯現出明顯優勢。與細胞活性因子相比，間充質干細胞可分泌多種細胞活性物質調控基質修復過程。與其他間充質干細胞相比，UC-MSCs因來源于分娩廢棄物，易獲取，且采取過程中不會給供體帶來任何痛苦而擁有廣闊的臨床應用前景[9]。在對UC-MSCs治療肺纖維化的機制研究中，有研究[10]認為UC-MSCs可在肺部分化為肺泡上皮細胞，直接修復損傷肺組織，抑制肺部纖維化，但UC-MSCs肺部植入率偏低，且不具有定向分化為肺泡上皮細胞的能力，故轉分化機制不應是UC-MSCs治療肺纖維化的主要機制。大部分研究[11-12]表明UC-MSCs可旁分泌細胞因子發揮調節作用，如直接分泌IL-10、IL-13抑制炎癥反應，抑制TGF-β、TNF-α、VEGF的產生或活性，調節MMPs/TIMPs平衡等。

鹽酸多西環素作為一種半合成抑菌類抗生素，已長期運用于臨床抗感染治療中。近年來發現其可以通過螯合Zn2+和Ca2+，特異性抑制MMPs活性，同時還能直接或間接抑制IL-1、NO、uPA釋放或表達來減輕纖維素滲出性病變[14]。現有研究[15]亦證明鹽酸多西環素可顯著減輕肺纖維化。該研究結果表明UC-MSCs、鹽酸多西環素均可減輕小鼠肺纖維化程度且二者聯合應用效果更佳，其機制可能為UC-MSCs聯合鹽酸多西環素可增強對MMP-9的抑制作用。

UC-MSCs與鹽酸多西環素聯用對肺纖維化的改善作用是否存在其他機制還需進一步探討。另外在博來霉素致小鼠肺損傷的早期，小鼠肺部感染的幾率增加，鹽酸多西環素可以有效控制感染，也是其減輕肺纖維化程度的原因[16]。

總之，早期應用UC-MSCs聯合鹽酸多西環素能夠顯著減輕小鼠肺纖維化程度，其機制可能為UC-MSCs能提高TIMP-1表達，且聯合鹽酸多西環素能夠抑制MMP-9的表達。該結果有可能為臨床治療肺纖維化提供新的思路。

參考文獻

[1]LEE AS,MIRA-AVENDANO I,RYU JH,et al.The burden of idiopathic pulmonary fibrosis: an unmet public health need[J].Respir Med,2014,108(7):955

[2]SHIMBORI C,GAULDIE J,KOLB M.Extracellular matrix microenvironment contributes actively to pulmonary fibrosis[J].Curr Opin Pulm Med,2013,19(5):446

[3]INAMDAR AC,INAMDAR AA.Mesenchymal stem cell therapy in lung disorders: pathogenesis of lung diseases and mechanism of action of mesenchymal stem cell[J].Exp Lung Res,2013,39(8):315

[4]崔冰,胡卓偉.抗肺纖維化藥物治療研究進展[J].生理科學進展,2008,39(3):233

[5]SZAPIEL SV,ELSON NA,FULMER JD,et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude, athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis,1979,120(4):893

[6]李麗娜,王華,周蕾,等.博萊霉素誘導小鼠肺間質纖維化造模方式的選擇[J].中國免疫學雜志,2010,26(3):254

[7]魏燕華,劉桂桃.肺纖維化的治療進展[J].臨床肺科雜志,2014,19(2):336

[8]INOMATA M,KAMIO K,AZUMA A,et al.Pirfenidone inhibits fibrocyte accumulation in the lungs in bleomycin-induced murine pulmonary fibrosis[J].Respir Res,2014,15:16

[9]HASHIMOTO N,JIN H,LIU T,et al.Bone marrow-derived progenitor cells in pulmonary fibrosis[J].J Clin Invest,2004,113(2):243

[10]CHOI M,BAN T,RHIM T.Therapeutic use of stem cell transplantation for cell replacement or cytoprotective effect of microvesicle released from mesenchymal stem cell[J].Mol Cells,2014,37(2):133

[11]SUN Z,WANG C,SHI C,et al.Activated Wnt signaling induces myofibroblast differentiation of mesenchymal stem cells, contributing to pulmonary fibrosis[J].Int J Mol Med,2014,33(5):1097

[12]王紅陽,劉晨,王雁,等.人臍帶血干細胞抑制大鼠肺纖維化及肺巨噬細胞TGF-β1的表達[J].細胞與分子免疫學雜志,2013,29(1):31

[13]WANG BL,TU YY,FU JF,et al.Unbalanced MMP/TIMP-1 expression during the development of experimental pulmonary fibrosis with acute paraquat poisoning[J].Mol Med Rep,2011,4(2):243

[14]LU HT,SHEU MT,LIN YF,et al.Injectable hyaluronic-acid-doxycycline hydrogel therapy in experimental rabbit osteoarthritis[J].BMC Vet Res,2013,9:68

[15]FUJITA H,SAKAMOTO N,ISHIMATSU Y,et al.Effects of doxycycline on production of growth factors and matrix metalloproteinases in pulmonary fibrosis[J].Respiration,2011,81(5):420

[16]MOLYNEAUX PL,MAHER TM.The role of infection in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis[J].Eur Respir Rev,2013,22(129):376

(2015-09-14收稿責任編輯徐春燕)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.014

#通信作者:郭悅鵬，男，1957年10月生，本科，主任醫師，教授，研究方向：呼吸疾病的基礎與臨床，E-mail:guoyuepeng2517@163.com；鐘根深，男，1981年3月生，博士，副教授，研究方向：生物治療的基礎及臨床研究，E-mail：zhonggs@xxmu.edu.cn

中圖分類號R563

關鍵詞臍帶間充質干細胞;鹽酸多西環素;肺纖維化;MMP-9;TIMP-1;小鼠

Effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation combined with doxycycline on mice with early stage pulmonary fibrosis

YANG Yu1)，YUAN Xiaomei1),ZHAO Xin1),WU Minna2),GAO Xinyuan1), XU Zhishan3), ZHONG Genshen3), GUO Yuepeng1)

1)DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Weihui4531002)DepartmentofMicrobiology,BasicMedicalCollege,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang4530003)LaboratoryofBiotherapy,InstituteofNeurologyinHenanProvince,Weihui453100

Key wordsUC-MSC;doxycycline hydrochloride;pulmonary fibrosis;MMP-9;TIMP-1;mouse

AbstractAim: To investigate the effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells(UC-MSCs) transplantation and doxycycline in a mice model of pulmonary fibrosis and its mechanism． Methods: A total of 40 C57BL/6 female mice were randomly allocated into 5 groups.Mice in control group were intratracheally injected with NS under operating microscope. Mice in other groups were intratracheally injected with bleomycin. After 48 h, mice in the control and model group were injected with normal saline via the tail vein, mice in the doxycycline group were injected with doxycycline via abdomen, mice in the stem cell group were injected with UC-MSCs via the tail vein,and mice in the combination treatment group were given UC-MSCs plus doxycycline. On the 28th day, the lung tissue was collected. Histopathological scoring of alveolitis and pulmonary fibrosis was performed according to Szapiel's method. The content of hydroxyproline was determined using alkaline hydrolysis method. The expressions of MMP-9 and TIMP-1 were determined using immunohistochemistry. Results: Compared with the model group, the alveolitis and pulmonary fibrosis in the stem cell group and doxycycline group alleviated, the content of hydroxyproline and the expression of MMP-9 decreased, while the expression of TIMP-1 increased, and the above parameters improved most significantly in the combination treatment group(P<0.05). Conclusion: UC-MSCs transplantation and doxycycline can relieve bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. The mechanism might be related with inhibiting MMP-9 and inducing TIMP-1 expression.

*國家自然科學基金資助項目81201765；新鄉醫學院研究生科研創新支持計劃資助項目YJSCX20406Z

*：5組間兩兩相比，P均<0.05。

*：與B組比較，P<0.05；△：與C組比較，P<0.05；#：與D組比較，P<0.05。