移植物中CCR6+及CCR7+ T細胞數量與異基因造血干細胞移植受者急性移植物抗宿主病發生的關系*

王　萌，徐　衍，孫　慧，謝新生，馬　杰，甘思林，劉延方

鄭州大學第一附屬醫院血液科 鄭州 450052

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移植物中CCR6+及CCR7+T細胞數量與異基因造血干細胞移植受者急性移植物抗宿主病發生的關系*

王萌，徐衍，孫慧，謝新生，馬杰，甘思林，劉延方#

鄭州大學第一附屬醫院血液科 鄭州 450052

摘要目的：探討移植物中表達趨化因子受體6(CCR6)或CCR7的T細胞數量與異基因造血干細胞移植后急性移植物抗宿主病(GVHD)發生的關系。方法：選取行親緣異基因造血干細胞移植的52對供受者為研究對象，經重組人粒細胞集落刺激因子動員后，測定并比較骨髓和外周血采集物中CCR6+或CCR7+T細胞的數量，分析輸注的各亞群T細胞數量與移植后受者發生Ⅱ-Ⅳ度急性GVHD的關系。 結果：動員后，外周血采集物中CD4+CCR6+、CD8+CCR6+、CD4+CCR7+及CD8+CCR7+ T細胞的絕對數量均較骨髓中增多(P<0.05)，是骨髓中的15～25倍，但移植物中上述各亞群細胞的絕對數量不是移植后受者發生急性GVHD的危險因素(P>0.05)。結論：移植后受者急性GVHD的發生可能與移植物中CCR6+ 或CCR7+ T細胞的數量無關。

異基因造血干細胞移植(allogenetic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)已成為治愈惡性血液病的重要方法之一，而移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)是allo-HSCT后的重要并發癥，也是導致移植失敗、影響患者生存和預后的重要因素之一[1-2]。一般把移植后100 d以內發生的GVHD稱為急性GVHD。急性GVHD是T細胞介導的炎癥性疾病，供者T細胞的激活和擴增以及炎性細胞因子的大量釋放是造成急性GVHD的兩大主要因素。而趨化因子及其受體介導的T細胞的遷移是急性GVHD發生發展的關鍵環節，已成為移植免疫研究的熱點。研究[3-4]表明，CCR6和CCR7與移植免疫密切相關，密切參與急性GVHD的發病機制。造血干細胞移植時移植物中CD4+CCR7+T細胞的比例已被證實可影響受者急性GVHD的發生[4-5]。該研究中作者比較了重組人粒細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)動員后骨髓采集物(G-BM)和外周血采集物(G-PB)中CCR6+或CCR7+T細胞的數量，并分析輸注的CCR6+及CCR7+T細胞數量和急性GVHD發生的關系，以進一步探索急性GVHD發生的可能機制。

1對象與方法

1.1研究對象回顧性分析2012年6月至2015年10月在鄭州大學第一附屬醫院行親緣allo-HSCT移植的病例52例，研究對象納入標準：①經檢測血白細胞及血小板達到植入標準，且移植100 d后經熒光染色體原位雜交或DNA位點短串聯重復序列多態性等檢測證實供者細胞完全植入者。②移植后100 d內仍存活且未復發者。52例移植受者中男18例，女34例，中位年齡36(2～59)歲，移植受者隨訪均超過100 d。從疾病診斷至移植的中位時間為135(78～386) d，疾病類型包括急性髓系白血病25例，急性淋巴細胞白血病14例，淋巴瘤7例，骨髓增生異常綜合征6例。所有病例均為骨髓+外周血造血干細胞移植。供受者HLA全相合22例，不全相合30例。移植時供者年齡中位數38(14～57)歲。

1.2預處理方案移植預處理采用改良Bu/Cy方案[移植前8～10 d靜脈輸注阿糖胞苷(Ara-C) 2 g/(m2·d)，移植前5～7 d口服白消安(Bu)4 mg/(kg·d)或靜脈輸注3.2 mg/(kg·d)，移植前3～4 d靜脈輸注環磷酰胺(Cy)1.8 g/(m2·d)]或改良Bu+Flu方案[移植前8～10 d靜脈輸注Ara-C 2 g/(m2·d)，移植前5～7 d 口服Bu 4 mg/(kg·d)或靜脈輸注3.2 mg/(kg·d)，移植前2～6 d靜脈輸注氟達拉濱(Flu)30 g/(m2·d)]。HLA不全相合親緣移植在預處理中均加用兔源ATG(總量10 mg/kg，分4次靜脈輸注)。

1.3急性GVHD的防治與診斷急性GVHD的常規預防采用環孢素A(CsA)+短程甲氨蝶呤(MTX)+霉酚酸酯(MMF)。CsA血藥濃度谷值維持在150～250 μg/L，預處理時開始加用，移植3個月后逐漸減量；MMF 7.5 mg/kg，2次/d，預處理時開始加用，移植后1個月停用；MTX 15 mg/m2(移植后第1 天)、10 mg/m2(移植后第3、5、11 天)。急性GVHD的診斷和分級參照文獻[6]。

1.4動員方案和標本的采集與測定所有供者皮下注射rhG-CSF[10 μg/(kg·d)]，連續5 d，在動員第4天采集供者骨髓干細胞800 mL(采集過程中輸注自體血400 mL)，在動員第5天行外周血干細胞單采。采集的骨髓及外周血干細胞均于采集后6 h內回輸給受者。采集時常規留取骨髓血5 mL，外周血采集物1 mL。標本留取后1 h內應用全自動血細胞分析儀進行白細胞計數，并同時涂片兩張，在顯微鏡下分類計數，24 h內進行熒光抗體標記及上機測定。標本均標記以下單抗：CD3-FITC、CD4-PerCP、CD8-PerCP、CCR6-PE(同型對照Mouse IgG1-PE)、CCR7-PE(同型對照Rat IgG2a-PE)，染色后經PBS洗滌，最后予多聚甲醛固定，6 h內用流式細胞儀測定CD3+CD4+/CD3+CD8+T細胞亞群的比例，CD3+CD4+及CD3+CD8+T細胞表面CCR6和CCR7的表達，最后計算移植物中各亞群T細胞的數量。所用流式細胞儀及主要試劑均購自美國BD公司。

1.5統計學處理應用SPSS 16.0處理數據，T細胞數量均以中位數和上下四分位數描述，組間數據的比較采用Mann-Whitney檢驗，急性GVHD的累積發生率采用Kaplan-Meier方法計算，組間比較采用Log-rank檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1比較G-BM和G-PB中各亞群T細胞數量經rhG-CSF動員后，G-BM和G-PB中各亞群細胞絕對數量見表1。由表1可見，與G-BM相比，G-PB中各亞群T細胞數量較多。

2.2輸注不同亞群的T細胞數量與受者發生Ⅱ-Ⅳ度急性GVHD的關系52例移植受者隨訪至移植后100 d，累計發生Ⅱ度、Ⅲ度和Ⅳ度急性GVHD分別為12例(23.1%)、6例(11.5%)和2例(3.8%)，發生的中位時間為移植后35(11～90) d。輸注不同亞群的T細胞數量與移植后受者發生急性GVHD的相關性分析結果見圖1。由圖1可知，輸注以下各亞群細胞的數量與受者急性GVHD的發生無關。

表1　G-BM和G-PB中各亞群T細胞數量比較(n=52)

表中數據為中位數(P25，P75)。

圖1　不同T細胞亞群(A→G)數量與移植后受者發生急性GVHD的關系

3討論

急性GVHD是allo-HSCT后重要的并發癥，CCR6及CCR7已被證實在急性GVHD的發生發展中極為重要。

CCR6是輔助性T(Th)17細胞及調節性T(Treg)細胞比較特異的標志[7]，而Treg細胞和Th17細胞均已被證實在GVHD的發生發展中發揮重要作用[8-9]。文獻[10]報道，在allo-HSCT后發生急性GVHD的患者體循環中CD161+CCR6+Th17細胞向GVHD靶器官遷移增多，CCL20(CCR6的配體)在靶器官的浸潤增加。Varona等[3]的研究證實，CCR6可以促使活化的同種異體的反應性CD4+T細胞向GVHD靶器官募集，從而認為CCR6能夠調控CD4+T細胞介導的急性GVHD反應，在GVHD的發生發展中起關鍵作用。 當急性GVHD出現時，T細胞向次級淋巴器官(SLO)的遷移減少，向GVHD靶器官的遷移增多[11]。而CCR7主要表達在幼稚和中心記憶T細胞上，作用在于調控T細胞向SLO的歸巢和遷移。當CCR7缺陷時，CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞和Th17細胞的遷移和功能受損[12-13]，從而可能致使受者發生急性GVHD的風險增高或GVHD的程度加重[8,14]。CCR7+間充質干細胞及樹突細胞已被證實能夠抑制急性GVHD的發生發展[15-16]。此外，CCR7缺陷亦可以損傷效應記憶T細胞的功能，從而導致GVHD加重[17]。以上研究提示CCR6及CCR7密切參與移植后急性GVHD的發病機制。

Choufi[4]認為輸注移植物中CD4+CCR7+細胞的相對比例超過76%時，容易發生急性GVHD。Waller等[5]證實當輸注的骨髓細胞中包含較多幼稚T細胞(CCR7+T細胞)時，移植后急性GVHD的發生率明顯下降，雖然兩者結果不相一致，但提示輸注的CD4+CCR7+細胞比例能夠影響移植后急性GVHD的發生發展。該研究中，輸注CCD6+及CCR7+T細胞數量的增加并未引起急性GVHD的風險升高或者降低，因此可以推測受者急性GVHD的發生與輸注T細胞的數量無關，而可能與移植物中不同T細胞亞群的相對比例有關。

有研究[18-19]表明，與輸注未去T細胞的移植物相比，輸注去T細胞的移植物能顯著降低慢性GVHD的發生率，但對急性GVHD無顯著影響。該研究中，移植物中CD3+CD4+及CD3+CD8+T細胞的數量亦與移植后急性GVHD的發生無關，與上述研究相符。此外，該研究結果亦表明，G-PB中各亞群T細胞數量均顯著高于骨髓。盡管G-PB中T細胞數量高于G-BM數倍，但與骨髓移植相比，外周血造血干細胞移植后急性GVHD的發生率并未進一步增高，支持輸注的T細胞數量不是移植后GVHD發生的影響因素的論述。

綜上所述，allo-HSCT后受者急性GVHD的發生與移植物中CCR6+及CCR7+T細胞的絕對數量無關，而可能與不同亞群T細胞的相對比例有關。

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(2015-12-22收稿責任編輯徐春燕)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.015

#通信作者，男，1962年5月生，博士，教授，研究方向：惡性血液病的診治， E-mail:liuyf371@163.com

中圖分類號R733

關鍵詞急性移植物抗宿主病；CC趨化因子受體6；CC趨化因子受體7；異基因造血干細胞移植

Correlation of quantity of CCR6+and CCR7+T lymphocytes in grafts with occurrence of acute graft-versus-host disease in recipients after allo-HSCT

WANG Meng, XU Yan, SUN Hui, XIE Xinsheng, MA Jie, GAN Silin, LIU Yanfang

DepartmentofHematology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsacute graft-versus-host disease;C-C chemokine receptor type 6;C-C chemokine receptor type 7;allogenetic hematopoietic stem cell transplantation

AbstractAim: To detect the quantity of T cell subsets expressing C-C chemokine receptor type 6(CCR6) or CCR7 in the grafts and analyze their correlation with the occurrence of acute graft-versus-host disease(GVHD). Methods: Fifty-two pairs of healthy donor and their recipients with family donor allogenetic hematopoietic stem cell transplantation(allo-HSCT) were included in this study. All the recipients were injected recombinant human granulocyte colony-stimulating factor(rhG-CSF) for mobilizing. The quantity of T cells expressing CCR6 or CCR7 in rhG-CSF mobilized bone marrow grafts(G-BM) and peripheral blood grafts(G-PB) were detected and compared. The correlation of the quantity of each subset cells with the cumulative incidence of grades Ⅱ to Ⅳ acute GVHD in recipients was analyzed.Results: After rhG-CSF mobilization, G-PB had obviously more T cells than G-BM(P<0.05). CD4+CCR6+, CD8+CCR6+, CD4+CCR7+ and CD8+CCR7+ T cells in G-PB were approximately 15-25 times more than those in G-BM. And the absolute counts of the above T cell subsets were not risk factors for acute GVHD(P>0.05).Conclusion: The quantity of T cell subsets may not be related to the occurrence of acute GVHD.

*國家自然科學基金資助項目U1504806