早期生長反應因子對U87MG細胞Aβ40表達的影響*

趙莘瑜，蘇　剛

鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052　△女，1972年2月生，博士，主任醫師，教授，研究方向：神經系統變性病和腦血管病,E-mail：cindy_zhaoxinyu@163.com

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早期生長反應因子對U87MG細胞Aβ40表達的影響*

趙莘瑜△，蘇剛

鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052△女，1972年2月生，博士，主任醫師，教授，研究方向：神經系統變性病和腦血管病,E-mail：cindy_zhaoxinyu@163.com

摘要目的：研究早期生長因子EGR1對U87MG細胞Aβ40表達的影響。方法：構建EGR1表達質粒并轉染U87MG(實驗組)，以轉染空白質粒的U87MG細胞作為對照。采用qRT-PCR法檢測兩組EGR1 mRNA的表達；收集細胞培養液用ELISA法檢測Aβ40的水平；提取總蛋白用蛋白印跡法檢測BACE1和PS1蛋白的表達。結果：質粒成功構建并表達。實驗組EGR1 mRNA表達水平較對照組明顯增高(P<0.001)；實驗組細胞培養液中Aβ40水平較對照組增高(P<0.001)；實驗組BACE1蛋白的表達較對照組增加(P<0.001)；兩組PS1蛋白的表達差異無統計學意義(P=0.367)。結論：EGR1在體外可能使Aβ40表達增加，且可能與上調BACE1有關。

早期生長反應因子(early growth response 1, EGR1)基因是即刻早期基因(immediate early gene, IEG)家族成員，是含有鋅指結構的核轉錄因子，該類基因在細胞受外部刺激后最先表達[1-2]。其在人腦內基礎表達量非常低，但在一定條件下能迅速被大量誘導[2]。最初研究[3]發現其與炎癥反應、免疫調節、生長分化相關。也有研究[4]發現EGR1與認知功能存在著密切聯系。文獻[5-6]論述了EGR1與人長時程記憶形成密切相關，EGR1在神經細胞內的表達是長期記憶形成和突觸可塑性地由短期轉變為長期必不可少的條件之一。研究[7]認為EGR1可能參與阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的發病過程。 有報道[7]證明EGR1可導致Taus蛋白磷酸化，形成神經纖維纏結，傾向于支持Tau蛋白假說；有學者[8]認為淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)過量表達使EGR1的表達水平降低，相反在APP基因敲除的實驗動物內EGR1的表達量增高，更傾向于支持β淀粉樣蛋白瀑布假說。EGR1參與AD的發病過程似乎得到了科學家們的共識，但具體的參與機制尚存爭議。研究[9]認為慢性炎癥、缺氧及應激等條件下可導致Aβ蛋白沉積和神經元損傷與丟失，EGR1作為一種早期生長反應因子在慢性炎癥、缺氧、應激條件下表達迅速增高[10]。以上證據提示EGR1是通過調節Aβ蛋白參與癡呆的發病過程。Aβ蛋白是β淀粉樣蛋白瀑布假說的分子基礎[11]，是APP病理代謝的產物，而BACE1和PS1是APP病理代謝過程中的關鍵酶[12]。作者構建了CMV-EGR1過表達載體，通過檢測惡性膠質瘤(U87MG)細胞Aβ40、BACE1及PS1的表達來初步探討EGR1對Aβ蛋白的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑 BACE1及PS1一抗購自Abcam公司，ELISA試劑盒(Aβ40)購自上海拜利生物公司，山羊抗兔二抗及GADPH一抗購于武漢三鷹生物公司；DMEM高糖培養基購自索萊寶公司，胎牛血清購自四季青生物公司；蛋白裂解液、RNA提取試劑盒購自康為公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；pCMV-EGR1-FLAG、空白載體CMV-EGFP-Kanamycin、XhoⅠ/KpnⅠ內切酶及Taq polymerase 由上海吉凱基因公司提供；qRT-PCR試劑盒、逆轉錄試劑盒、T4連接酶購自TAKARA公司。

1.2質粒構建 以pCMV-EGR1-FLAG質粒為模板，擴增目的基因。EGR1轉化子上游引物序列為5’-CACATCCGATCCACACAG-3’，下游引物序列為5’-CGTCGCCGTCCAGCTAGACCAG-3’,擴增產物大小為750 bp。反應體系：ddH2O 12.4 μL，5×Taq buffer 4 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)1.6 μL，上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，模板1 μL，Taq polymerase 0.2 μL。反應條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃30 s ，72 ℃ 40 s 30個循環；72 ℃ 5 min，割膠純化。載體酶切：用XhoⅠ/KpnⅠ內切酶對質粒載體進行酶切。反應體系：ddH2O 40.5 μL，10×buffer 15 μL，100×BSA 0.5 μL，純化的DNA質粒(1 g/L)2 μL，XhoⅠ(10 kU/L)1 μL，KpnⅠ(10 kU/L)1 μL。37 ℃下酶切2 h。重組質粒構建：將添加了黏性末端的EGR1 cDNA與空載體混合，在T4連接酶的作用下進行連接反應，用感受態的大腸桿菌轉化，于4 ℃過夜；37 ℃培養轉化的大腸桿菌1 d，在含有卡那霉素的LB培養基上篩選克隆。結果鑒定：擴大培養后，用質粒提取試劑盒提取后對轉化子行PCR鑒定。送樣本至吉凱生物公司進行測序鑒定，結果與GenBank上EGR1(NM_001964)比較。

1.3細胞培養、質粒轉染及總蛋白的提取 細胞培養：將U87MG細胞接種于25 mL培養瓶中，置于37 ℃、體積分數5%CO2的細胞培養箱中培養，培養液為DMEM高糖培養基。根據細胞生長情況約2～3 d換液1次。質粒轉染：取生長良好的U87MG細胞按照Lipofectamine 2000說明書操作進行轉染。并在轉染6 h后于熒光顯微鏡(×200)下觀察，轉染成功后繼續培養細胞2 d后提取總蛋白。總蛋白提取：將細胞用胰酶消化2 min，轉移至2 mL離心管中1 500×g離心5 min，棄上清，加入2 μL蛋白酶抑制劑2 min后加入198 μL細胞裂解液，反復吹打均勻，于冰上裂解20 min，13 000×g4 ℃下離心10 min。BCA法測蛋白濃度，將各管蛋白濃度調整至相同水平，加入lodding煮沸5 min，置于-80 ℃冰箱備用，實驗重復3次。

1.4EGR1 mRNA的qRT-PCR檢測 采用Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書進行操作，以GADPH為內參，引物見1.2。反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s重復40個循環，采用2-ΔΔCt法進行數據的相對定量分析，實驗重復3次。

1.5BACE1、PS1的蛋白印跡實驗 取30 μg總蛋白樣品(約25 μL)于120 V恒定電壓條件下電泳90 min。于220 mA恒定電流條件下將電泳過的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。將膜置于50 g/L的脫脂牛奶中室溫封閉2 h。將封閉后的硝酸纖維素膜置于2 mL單克隆抗體稀釋液中4 ℃過夜。次日用TBST液漂洗3次，每次10 min。用TBST將二抗稀釋2 000倍，在搖床上孵育1 h，用TBST漂洗5次，每次10 min。于暗室中用ECL發光液曝光。實驗以GAPDH作為內參對照。用Image J軟件進行灰度值分析，以目的蛋白與內參灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量，實驗重復3次。

1.6Aβ40蛋白的酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測 轉染成功后繼續培養48 h后更換為無血清DMEM培養基，收集無血清細胞培養液。取無血清培養液用TCA進行蛋白質沉淀，4 ℃過夜。按照Aβ40的ELISA說明書步驟操作，每樣本設2個復孔。實驗重復3次。

1.7統計學處理采用SPSS 21.0分析，兩組EGR1 mRNA和BACE1、PS1蛋白的表達以及Aβ40水平比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1EGR1轉化子鑒定結果 重組質粒轉化成功(圖1)。測序結果與GenBank一致。

M:Marker;1～5:EGR1轉化子。圖1　EGR1轉化子鑒定

2.2質粒轉染情況熒光顯微鏡下可見綠色梭形細胞，表明重組質粒成功轉染了U87MG細胞(圖2)。

圖2　CMV-EGR1-EGFP轉染6 h后熒光顯微鏡圖(×200)

2.3兩組U87MG細胞EGR1 mRNA的表達和Aβ40水平情況見表1。

2.4兩組U87MG細胞BACE1和PS1蛋白的表達情況見圖3、4和表1。

1：實驗組；2：對照組。圖3　各組BACE1蛋白的表達情況

1：實驗組；2：對照組。圖4　各組PS1蛋白的表達情況

組別nEGR1mRNAρ(Aβ40)/(mg·L-1)BACE1蛋白PS1蛋白實驗組33.042±0.1740.365±0.0290.452±0.0070.234±0.013對照組31.002±0.0730.191±0.0270.151±0.0040.231±0.012t18.75522.839212.7810.910P<0.001<0.001<0.0010.367

3討論

APP的正常代謝不產生Aβ蛋白，而是經過α剪切酶的作用產生對神經細胞有保護作用的sAPPα[13]；當APP進入非正常代謝途徑時，BACE1作用于APP，剪切產生APP-βCTF和可溶性片段sAPPβ；APP-βCTF進一步被γ分泌酶作用，最后釋放Aβ40和Aβ42[14]。γ分泌酶為四聚體結構，由PS1、APH1、PSEN2、NCT四個亞基構成，其中PS1是其催化亞基[15]。因此BACE1和PS1在APP的病理剪切過程中起著重要作用。由于Aβ42分泌量較Aβ40少很多，考慮到蛋白濃度過低時對實驗結果影響較大，作者僅檢測Aβ40蛋白濃度。

有研究[3]表明EGR1與AD關系密切。Hendrickx等[4]闡明了EGR1的過表達可以導致APP蛋白表達增多，在酶活性和總量不變的情況下，也可導致Aβ蛋白的增加。該研究結果顯示外源性的EGR1成功轉染U87MG細胞后，細胞培養液中Aβ40分泌量較對照組明顯增加。研究[16]發現APP的剪切過程在很大程度上決定了Aβ蛋白的表達量，這說明Aβ蛋白的產生主要來自于APP的異常代謝。BACE1介導APP的病理剪切，并對Aβ蛋白的表達起著重要作用。PS1對Aβ蛋白的產生也起有一定的作用。因此作者推測實驗組Aβ40的增多可能是由于EGR1在參與APP異常剪切的過程時，關鍵酶BACE1和PS1表達增加所導致的結果。

該研究結果顯示實驗組BACE1蛋白的表達較對照組增高。目前尚無相關研究表明EGR1與BACE1之間有明確關系。有學者[17]指出溶血卵磷脂酸能通過上調BACE1的表達影響Aβ的形成，提示EGR1使Aβ40的表達增高可能是因為BACE1的表達上調所導致。PS1是γ分泌酶四聚體的穩定表達成分，其表達的高低可以在一定程度上代表γ分泌酶的表達。雖然有研究[18]表明γ分泌酶能很大程度上影響Aβ蛋白的形成，但目前尚無明確證據顯示EGR1對PS1的表達有影響。該研究結果顯示兩組PS1蛋白的表達差異無統計學意義，說明EGR1可能不會通過調節γ分泌酶的量而影響Aβ蛋白的表達。

綜上所述，過表達EGR1可能刺激U87MG細胞內Aβ40的表達，并且可能與BACE1的上調相關。該結論尚需進一步實驗驗證。

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(2015-10-11收稿責任編輯李沛寰)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.020

中圖分類號R742

關鍵詞阿爾茨海默病；Aβ40；EGR1;U87MG細胞

Effect of early growth response 1 on expression of Αβ40 in U87MG cells

ZHAO Xinyu,SU Gang

DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsAlzheimer′s disease;beta amyloid protein 40;early growth response 1;U87MG cells

AbstractAim: To research the effect of early growth response 1(EGR1) on the expression of beta amyloid protein 40(Aβ40) U87MG cells. Methods: To construct overexpression plasmid of CMV-EGFP-EGR1-Kanamycin and transfect U87MG cells as the experimental group; the control group cells were transfected by the plasmids of CMV-EGFP-Kanamycin. The expression of EGR1 mRNA was detected by qRT-PCR. The culture media was collected and Aβ40 was detect by ELISA. The total proteins of U87MG cells from the 2 groups was extracted and BACE1 and PS1 was measure by Western blot.Results: The experimental group and the control group were transfected by plasmids successfully. The expression of EGR1 mRNA increased significantly in the experimental group compared with the control group(P<0.001). Average concentration of Aβ40 was significantly higher in the experimental group than that in the control group(P<0.001). There was a significant increase of BACE1 protein level in the experimental group than that in the control group(P<0.001).There was no significant difference in PS1 protein level between the two groups(P=0.367).Conclusion: EGR1 can increase the expression of Aβ40 in vitro, which may associate with up-regulating the expression of BACE1 protein.

*河南省科技廳基礎與前沿項目340600531605；河南省教育廳自然科學研究計劃12A320072