自噬對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)生長相關(guān)蛋白-43及微管相關(guān)蛋白-2表達(dá)的影響①

張文彥，劉金霞，劉斌，鄧春穎，張晉霞，馬原源，毛文靜，李世英，呂超男

專題自噬與神經(jīng)功能

自噬對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)生長相關(guān)蛋白-43及微管相關(guān)蛋白-2表達(dá)的影響①

張文彥，劉金霞，劉斌，鄧春穎，張晉霞，馬原源，毛文靜，李世英，呂超男

目的探討自噬對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)突觸可塑性相關(guān)蛋白生長相關(guān)蛋白-43（GAP-43）和微管相關(guān)蛋白-2 （MAP-2）表達(dá)的影響。方法96只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、血管性癡呆模型組（VD組）、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤預(yù)處理組（3-MA組）和自噬激動劑雷帕霉素預(yù)處理組（Rap組）。每組又分為模型制備成功后1周、2周、4周、8周四個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。應(yīng)用改良Pulsinelli四血管阻斷法制備血管性癡呆模型。采用免疫組化法檢測大鼠海馬CA1區(qū)GAP-43、MAP-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果與Sham組比較，VD組各時(shí)間點(diǎn)GAP-43蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01），MAP-2蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.01）；與VD組比較，3-MA組各時(shí)間點(diǎn)GAP-43、MAP-2蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05），Rap組各時(shí)間點(diǎn)GAP-43、MAP-2蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。結(jié)論自噬抑制血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)突觸可塑性相關(guān)蛋白GAP-43、MAP-2表達(dá)，抑制自噬可能有利于血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)突觸重塑。

血管性癡呆；自噬；生長相關(guān)蛋白-43；微管相關(guān)蛋白-2；突觸可塑性；大鼠

［本文著錄格式］張文彥，劉金霞，劉斌，等.自噬對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)生長相關(guān)蛋白-43及微管相關(guān)蛋白-2表達(dá)的影響［J］.中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（7）:745-749.

CITED AS:Zhang WY，Liu JX，Liu B，et al.Effects of autophagy on expression of growth-associated protein-43 and microtubule associated protein-2 in CA1 area of hippocampus of vascular dementia rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（7）:745-749.

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指由腦血管性因素造成，臨床表現(xiàn)為智力減退、認(rèn)知功能障礙的一種臨床綜合征，病程呈緩慢進(jìn)展，是老年期癡呆常見病因之一［1-2］。慢性缺血缺氧和低灌注是VD的重要原因，有關(guān)自噬激活和突觸可塑性損傷等觀點(diǎn)在VD發(fā)病中所發(fā)揮的作用越來越受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。我們的前期研究顯示，自噬和突觸可塑性相關(guān)蛋白在VD的發(fā)病中有重要作用［3-4］。生長相關(guān)蛋白-43 （growth-associated protein-43，GAP-43）和微管相關(guān)蛋白-2（microtubule associated protein-2，MAP-2）是神經(jīng)元重塑的常用分子標(biāo)志物［5-6］。本研究探討自噬對VD大鼠海馬CA1區(qū)GAP-43和MAP-2表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠96只，月齡2～3個(gè)月，體質(zhì)量240～260 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號SCXK（京）2013-0013。在華北理工大學(xué)屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)室自由進(jìn)食喂養(yǎng)，室溫（24±2）℃，自然光照，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)2周。

1.2主要試劑

兔抗大鼠GAP-43多克隆抗體、兔抗大鼠MAP-2多克隆抗體和山羊血清封閉液：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3主要儀器

腦立體定位儀：NARISHIGE公司。光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS公司。動物電凝儀：張家港市航天醫(yī)療電器有限公司。組織切片機(jī)：德國LEITZ公司。

1.4動物分組

將大鼠編號，隨機(jī)數(shù)生成器隨機(jī)抽取不同數(shù)字，將大鼠分為假手術(shù)組（Sham組）、VD模型組（VD組）、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）預(yù)處理組（3-MA組）和自噬激動劑雷帕霉素預(yù)處理組（Rap組）。每組又分為模型制備成功后1周、2周、4周、8 周4個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只大鼠。

1.5模型制備及處理

采用改良Pulsinelli四血管阻斷（4-VO）法制備VD大鼠模型［7］。VD組10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。電凝針燒灼雙側(cè)C1橫突孔內(nèi)椎動脈，使其永久閉塞。消毒、縫合。分離雙側(cè)頸總動脈，并穿線備用。24 h后，動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，每次5 min，間隔10 min，反復(fù)3次。觀察到大鼠四肢及尾巴僵硬，尾巴向上強(qiáng)直卷曲，翻正反射消失。

3-MA組麻醉后，將鼠頭固定于立體定向儀上，切開頭皮，分離皮下組織，蘸少量10%雙氧水擦拭顱骨以充分暴露前囟的“十字交叉”骨性結(jié)構(gòu)。側(cè)腦室立體定位［8］：顱骨前囟門點(diǎn)（Bregma點(diǎn)）旁開0.9 mm，向后1.5 mm，并標(biāo)記。微型牙科鉆將顱骨緩緩鉆透，有明顯穿透感后拔出，到達(dá)硬腦膜表面即可。微量進(jìn)樣器抽吸10 mmol/L 3-MA溶液6μl，沿鉆孔緩慢進(jìn)針，深3.8 mm，5 min內(nèi)勻速緩慢注完，留針5 min后緩慢拔針。側(cè)腦室注射完畢后同VD組造模。

Rap組同3-MA組注射8 ng/μl雷帕霉素溶液4μl。同法造模。

Sham組只暴露雙側(cè)頸總動脈及第1頸椎橫突孔，不進(jìn)行椎動脈電凝及頸總動脈夾閉。

術(shù)后，大鼠均予以腹腔注射慶大霉素1萬U/kg，共3 d，以預(yù)防感染。

行Morris水迷宮測試，觀察大鼠穿越平臺次數(shù)，篩選出造模成功的大鼠［3，9］。術(shù)后4周左右，大鼠出現(xiàn)VD行為學(xué)改變，其中5只由于病情過重淘汰，另有3只死亡，均給予相應(yīng)補(bǔ)充。

1.6免疫組織化學(xué)染色

各組大鼠于術(shù)后預(yù)定時(shí)間點(diǎn)取材。腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，仰臥固定于操作臺上。劍突下剪開胸腔，充分暴露心臟，灌注針從心尖插入至左心室并固定針尖位置；剪開右心耳，注射生理鹽水約250 ml，待大鼠肝臟無明顯血色、右心耳流出清涼液體后，灌注4%多聚甲醛溶液約180 ml，見大鼠肢體抽動、尾巴僵直，快速斷腦，迅速剝離腦組織置多聚甲醛溶液中，4℃冰箱放置24～36 h；切取視交叉前后3 mm腦組織脫水、透明、浸蠟包埋。石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，厚約5 μm，用經(jīng)泡酸、沖水、烤干、多聚賴氨酸溶液處理后的載玻片撈片，晾干后60℃烤箱中24～36 h備用。

取制備好的組織標(biāo)本，加入正常羊血清封閉液中，分別滴加兔抗大鼠GAP-43多克隆抗體（1∶600）及兔抗大鼠MAP-2多克隆抗體（1∶300），4℃過夜；PBS液沖洗，滴加二抗37℃溫箱孵育1 h；PBS液沖洗，DAB顯色。操作步驟嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行。

鏡下細(xì)胞內(nèi)GAP-43、MAP-2蛋白被染成棕黃色或淺黃色顆粒，位于胞漿。高倍鏡下隨機(jī)選取大鼠海馬CA1區(qū)6個(gè)視野，進(jìn)行GAP-43、MAP-2蛋白陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)以Excel軟件建庫，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2結(jié)果

2.1GAP-43

Sham組可見散在GAP-43陽性細(xì)胞，表達(dá)于胞漿及突起。VD組1周時(shí)可見較多GAP-43陽性表達(dá)細(xì)胞，隨著時(shí)間延長逐漸減少，8周時(shí)最少；與Sham組比較，VD組各時(shí)間點(diǎn)GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增加（P＜0.01）。與VD組比較，3-MA組各時(shí)間點(diǎn)GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05），Rap組各時(shí)間點(diǎn)GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）。見圖1、表1。

2.2MAP-2

Sham組可見MAP-2陽性細(xì)胞表達(dá)于胞漿及突起。VD組1周時(shí)可見較少M(fèi)AP-2陽性表達(dá)，隨著時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng)，4周達(dá)到高峰，8周開始減少；與Sham組比較，VD組各時(shí)間點(diǎn)MAP-2陽性細(xì)胞數(shù)均明顯減少（P＜0.01）。與VD組比較，3-MA組各時(shí)間點(diǎn)MAP-2陽性細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05），Rap組各時(shí)間點(diǎn)MAP-2陽性細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.01）。見圖2、表2。

圖1　　各組大鼠海馬CA1區(qū)GAP-43表達(dá)（免疫組化染色，400×）

表1　　各組不同時(shí)間點(diǎn)GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)（/高倍視野）

表2　　各組不同時(shí)間點(diǎn)MAP-2陽性細(xì)胞數(shù)（/高倍視野）

3討論

自噬是存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)和對不良環(huán)境的一種防御機(jī)制，參與清除細(xì)胞廢物、結(jié)構(gòu)重建和生長分化等［10-11］；自噬也參與諸如VD等多種疾病的病理過程［3-4，12］，無論是自噬過度還是不足都可導(dǎo)致疾病發(fā)生。

突觸是實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元信息傳遞的基本結(jié)構(gòu)單位，其形態(tài)、數(shù)量的改變即為突觸可塑性。突觸可塑性是神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育、損傷修復(fù)及學(xué)習(xí)記憶等活動的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)［13-14］。GAP-43和MAP-2是神經(jīng)元重塑的常用分子標(biāo)志物。

GAP-43含有226～243個(gè)氨基酸，又被稱B50、F1、PP46、神經(jīng)調(diào)素，存在于突觸前膜、生長錐、胞漿中，可通過與膜脂肪酸共價(jià)連接而與神經(jīng)元膜結(jié)合，可從生長錐或突觸膜表面伸展開來，可逆地附著在膜表面；又可與胞質(zhì)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白相互作用［15］。GAP-43是神經(jīng)元特異性突觸前膜蛋白，作為神經(jīng)再生的標(biāo)志，是神經(jīng)元生長期的內(nèi)在決定因子［16］；在損傷后主要通過側(cè)支出芽等方式進(jìn)行結(jié)構(gòu)重塑［17］；其表達(dá)與成年動物神經(jīng)元軸突再生及可塑性密切相關(guān)［18］，發(fā)揮突觸可塑性的調(diào)節(jié)作用。

MAP-2屬于結(jié)構(gòu)性微管相關(guān)蛋白家族，是一種高度保守的熱穩(wěn)定磷蛋白，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元胞體和樹突［19］，在神經(jīng)元發(fā)育早期和成年后突觸構(gòu)成期表達(dá)，調(diào)節(jié)微管的可逆性聚合作用及其穩(wěn)定性［20］。MAP-2在維持神經(jīng)元及突觸的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能過程中起重要作用，參與突觸可塑性調(diào)節(jié)。

自噬及突觸可塑性相關(guān)蛋白在VD的發(fā)病中均有重要作用［3-4］，但自噬與突觸可塑性之間在VD發(fā)病中是否存在關(guān)聯(lián)，目前文獻(xiàn)報(bào)道較少。3-MA是一種常用的細(xì)胞自噬抑制劑［21］，能通過抑制自噬體形成過程中的三型磷脂酰肌醇激酶3（PI3K）抑制自噬體形成。雷帕霉素是一種新型免疫抑制劑，能與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）特異性結(jié)合，抑制mTOR的蛋白激酶活性，誘導(dǎo)自噬發(fā)生［22］。

本研究顯示，自噬對VD大鼠海馬CA1區(qū)突觸可塑性相關(guān)蛋白GAP-43、MAP-2表達(dá)可能具有抑制作用，抑制自噬有利于VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)突觸重塑。

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Effects of Autophagy on Expression of Growth-associated Protein-43 and Microtubule Associated Protein-2 in CA1Area of Hippocampus of Vascular Dementia Rats

ZHANG Wen-yan，LIU Jin-xia，LIU Bin，DENG Chun-ying，ZHANG Jin-xia，MA Yuan-yuan，MAO Wen-jing，LI Shi-ying，Lü Chao-nan
First Department of Neurology，the Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China
Correspondence to LIU Bin.E-mail:liubintsh@126.com

Objective To observe the effects of autophagy on the expression of synaptic plasticity related protein，growth-associated protein-43（GAP-43）and microtubule associated protein-2（MAP-2），in CA1 area of hippocampus of vascular dementia rats.Methods Ninety-six healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group，vascular dementia model group（VD group），autophagy inhibitor 3-methyl adenine preconditioning group（3-MA group）and autophagy agonist rapamycin preconditioning group（Rap group）.Each group was divided randomly into subgroups of one week，two weeks，four weeks and eight weeks after modeling，six rats in each group.The vascular dementia rat model was established with modified Pulsineli's four-vessel occlusion.The expression of GAP-43 and MAP-2 in CA1 area of hippocampus were detected with immunohistochemistry.Results Compared with the sham group，the expression of GAP-43 protein increased，and the expression of MAP-2 protein decreased at every time point in VD group（P＜0.01）.Compared with VD group，the expression of both GAP-43 and MAP-2 increased in 3-MA group（P＜0.05），and decreased in Rap group（P＜0.05）.Conclusion Autophagy may inhibit the expression of synaptic plasticity related protein，GAP-43 and MAP-2，in CA1 area of hippocampus in vascular dementia rats，indicating inhibition of autophagy may promote synaptic remodeling.

vascular dementia；autophagy；growth-associated protein-43；microtubule associated protein-2；synaptic plasticity；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.001

R743

A

1006-9771（2016）07-0745-05

1.河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（No.ZH2012046）；2.河北省級重大醫(yī)學(xué)科研課題（No.zd2013087）。

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，河北唐山市063000。作者簡介：張文彥（1974-），女，漢族，河北唐山市人，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：腦血管病。通訊作者：劉斌，男，碩士，主任醫(yī)師，教授，研究生導(dǎo)師。E-mail:liubintsh@126.com。

2016-03-15

2016-04-22）