復(fù)方腦肽節(jié)苷脂注射液激活線粒體自噬改善腦缺血再灌注損傷①

王明洋，馮璐，范姝婕，鄭吉，李冬梅，楊楠，左萍萍，劉雁勇

復(fù)方腦肽節(jié)苷脂注射液激活線粒體自噬改善腦缺血再灌注損傷①

王明洋，馮璐，范姝婕，鄭吉，李冬梅，楊楠，左萍萍，劉雁勇

目的觀察復(fù)方腦肽節(jié)苷脂注射液（CPCGI）對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用并探討其機(jī)制。方法Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、CPCGI低劑量治療組、CPCGI高劑量治療組、陽(yáng)性藥金納多組，每組10只。線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈梗阻2 h后復(fù)灌模型，即刻給藥，連續(xù)14 d。術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d行神經(jīng)功能癥狀缺損評(píng)分，術(shù)后14 d行貼紙去除及平衡木行走實(shí)驗(yàn)，Western blotting檢測(cè)損傷周?chē)X組織Beclin1、PINK1及Parkin的表達(dá)。結(jié)果術(shù)后14 d，與模型組相比，各給藥組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低（P＜0.05），大鼠過(guò)桿時(shí)間明顯縮短（P＜0.01），CPCGI給藥組去除兩側(cè)前肢貼紙的時(shí)間縮短（P＜0.05）。模型組皮層組織中Beclin1及Parkin蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.01），PINK1蛋白表達(dá)明顯上升（P＜0.01），CPCGI各組均能逆轉(zhuǎn)該作用（P＜0.05）。結(jié)論CPCGI的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制之一可能與激活線粒體自噬，改善線粒體功能有關(guān)。

腦缺血再灌注損傷；復(fù)方腦肽節(jié)苷脂注射液；線粒體自噬；大鼠

［本文著錄格式］王明洋，馮璐，范姝婕，等.復(fù)方腦肽節(jié)苷脂注射液激活線粒體自噬改善腦缺血再灌注損傷［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（7）:750-753.

CITED AS:Wang MY，F(xiàn)eng L，F(xiàn)an SJ，et al.Effect of Compound Porcine Cerebroside and Ganglioside Injection on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（7）:750-753.

腦卒中是目前全球第二大致死性疾病，且致殘率最高［1-2］。神經(jīng)保護(hù)劑對(duì)腦卒中患者的恢復(fù)有重要作用［3］。復(fù)方腦肽節(jié)苷脂注射液（Compound Porcine Cerebroside and Ganglioside Injection，CPCGI）是一復(fù)方制劑，其主要成分為多肽、多種神經(jīng)節(jié)苷脂、次黃嘌呤等。臨床研究顯示，CPCGI對(duì)阿爾茨海默病有明顯改善作用［4］，并可用于腦缺血等腦部疾病引起的功能障礙的治療。但其藥理作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

缺血再灌注損傷是腦卒中重要的病理生理機(jī)制之一，而線粒體功能障礙在此過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［5］。由于神經(jīng)元的正常生理活動(dòng)依賴于線粒體產(chǎn)生的ATP作為能量供體［6］，調(diào)控并維持線粒體的正常功能對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能的執(zhí)行至關(guān)重要［7-8］。本研究采用大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，從改善線粒體功能方面對(duì)CPCGI的抗腦缺血再灌注損傷機(jī)制進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)。

1材料和方法

1.1試劑

CPCGI（國(guó)藥準(zhǔn)字H22026472）：吉林步長(zhǎng)制藥有限公司。銀杏葉提取物注射液（金納多）：中豪國(guó)際有限公司。硅膠線栓：北京西濃科技有限公司。戊巴比妥鈉：SIGMA公司。小鼠抗Parkin抗體、兔抗Beclin1抗體：CST公司。兔抗PINK1抗體：SANTA CRUZ公司。小鼠抗β-actin抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗及辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Western blotting實(shí)驗(yàn)相關(guān)材料：北京普利萊生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量260～280 g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（軍）2012-0004。SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，光照12 h/12 h明暗交替，自由飲食。大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后，線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型。將模型制作成功的大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成模型組、CPCGI低劑量治療組（0.5 ml/kg，相當(dāng)于多肽1.6 mg/kg，腹腔注射）、高劑量治療組（1 ml/kg，相當(dāng)于多肽3.2 mg/kg，腹腔注射）、金納多組（50 mg/kg，腹腔注射），每組大鼠10只。各組大鼠缺血2 h后再灌注即開(kāi)始給藥。假手術(shù)組和模型組大鼠給生理鹽水1 ml/kg腹腔注射。連續(xù)給藥14 d。

1.3模型制備

參照Longa法［9］建立大鼠MCAO模型。術(shù)前12 h禁食不禁水。大鼠1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。備皮，碘伏消毒。沿頸正中線切開(kāi)皮膚，鈍性分離右側(cè)頸部肌肉，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈。結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng)脈，在距分支5 mm處用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端。在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎處與動(dòng)脈夾之間剪一小口，插入直徑0.26 mm的圓頭硅化栓線（用0.1%多聚賴氨酸包被）至頸內(nèi)動(dòng)脈，最終栓線頭部膨大端進(jìn)入大腦中動(dòng)脈阻斷血流供應(yīng)。2 h后小心抽出栓線。手術(shù)過(guò)程注意大鼠保溫。

假手術(shù)組只進(jìn)行手術(shù)過(guò)程而不插線。

1.4行為學(xué)評(píng)價(jià)

1.4.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分

各組動(dòng)物分別在術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分［10］，包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡能力測(cè)試等［11］。分?jǐn)?shù)越高，損傷越嚴(yán)重。

1.4.2貼紙去除實(shí)驗(yàn)

各組動(dòng)物術(shù)后14 d行貼紙去除實(shí)驗(yàn)［12］。用2片邊長(zhǎng)10 mm的正方形粘性紙將大鼠2個(gè)前肢掌面粘住（粘性程度以正常大鼠10 s內(nèi)將粘性紙咬掉為佳），將大鼠置于測(cè)試圓筒中，大鼠會(huì)本能地將紙片咬掉。觀察并記錄大鼠去除兩側(cè)紙片的總時(shí)間，若120 s內(nèi)未去除紙片，記為120 s。

1.4.3平衡木行走實(shí)驗(yàn)

各組動(dòng)物術(shù)后14 d行平衡木行走實(shí)驗(yàn)［13］。平衡木為105×4×3 cm木條，兩端固定使木條離地80 cm。起始點(diǎn)為陡峭平臺(tái)，終點(diǎn)為一平臺(tái)。記錄大鼠四肢均通過(guò)整個(gè)平衡木的時(shí)間；超過(guò)120 s未通過(guò)整個(gè)平衡桿記為120 s，大鼠從平衡桿跌落記為超過(guò)120 s未通過(guò)。測(cè)試前大鼠每天訓(xùn)練1次，共訓(xùn)練2 d。

1.5Western blotting

除金納多組外，各組動(dòng)物于行為學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)束后立即斷頭處死，分離腦組織，于液氮中猝冷。取損傷側(cè)大腦皮層組織50 mg左右，置于冰上的EP管中，加入10倍體積組織裂解液（RIPA∶蛋白酶抑制劑∶蛋白磷酸酶抑制劑=100∶1∶1），冰浴中超聲破碎儀破碎1 min，充分勻漿后冰上裂解20 min；4℃12000 r/min離心15 min，取上清。Bradford法測(cè)定蛋白濃度。4∶1比例加入5×蛋白上樣緩沖液，97℃變性6 min，取蛋白樣品50 μg行SDS-PAGE電泳。80 V恒壓電泳至樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)整為110 V恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)條帶接近電泳槽底部；200 mA恒流電轉(zhuǎn)將蛋白印跡轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；加入5%脫脂奶粉封閉1 h；去除封閉液，加入稀釋好的一抗（小鼠抗Parkin抗體，1 ∶1000；兔抗PINK1抗體，1∶200；兔抗Beclin1抗體，1∶1000；小鼠抗β-actin抗體；1∶1000），4℃過(guò)夜；洗膜后加入稀釋好的二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗，1∶5000），室溫孵育1h；膜清洗后置于ECL發(fā)光液中顯色，ECL熒光檢測(cè)儀中顯影。Gelpro軟件灰度掃描，采用百分比歸一法比較各組之間目的蛋白的表達(dá)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分

假手術(shù)組無(wú)明顯神經(jīng)功能損傷。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分在術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d均顯著增加（P＜0.001），各給藥組大鼠經(jīng)過(guò)治療14 d后，與模型組相比降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1　　各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

2.2貼紙去除實(shí)驗(yàn)

模型組去除貼紙時(shí)間與假手術(shù)組相比顯著延長(zhǎng)（P＜0.001）。CPCGI低、高劑量組去除貼紙時(shí)間均較模型組縮短（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3平衡木行走實(shí)驗(yàn)

模型組過(guò)桿時(shí)間與假手術(shù)組大鼠相比顯著延長(zhǎng)（P＜0.001）。CPCGI低、高劑量組，金納多組過(guò)桿時(shí)間與模型組相比明顯縮短（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2　　各組感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)功能比較（s）

2.4Western blotting

模型組Beclin1的表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低（P＜0.01），而CPCGI低、高劑量組均能提高其表達(dá)（P＜0.05）。

模型組PINK1的表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.01），Parkin表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。CPCGI低、高劑量組PINK1表達(dá)較模型組降低（P＜0.05），CPCGI高劑量組Parkin表達(dá)升高（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3　　各組腦組織Beclin1、PINK1及Parkin蛋白表達(dá)

3討論

本研究顯示，CPCGI對(duì)腦缺血再灌注損傷的治療作用與陽(yáng)性藥金納多療效相當(dāng)，能促進(jìn)模型大鼠的感覺(jué)功能及軀體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能的恢復(fù)。

腦缺血再灌注損傷使腦神經(jīng)元內(nèi)線粒體膜通透性改變及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，細(xì)胞色素C大量釋放等，導(dǎo)致線粒體功能障礙［14］。受損線粒體不僅無(wú)法產(chǎn)生足夠能量供給神經(jīng)元，還會(huì)生成活性氧、自由基，導(dǎo)致氧化損傷進(jìn)一步加重［15］。

自噬的主要功能是將胞質(zhì)中一些損壞的細(xì)胞器通過(guò)溶酶體途徑降解，實(shí)現(xiàn)能量的再循環(huán)，以維持細(xì)胞自身的穩(wěn)定［16］。Beclin1是哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬的標(biāo)記性蛋白，主要調(diào)控自噬體的形成與成熟，屬特異性基因［17-18］。我們檢測(cè)到模型組大鼠損傷側(cè)皮層組織蛋白中Beclin1表達(dá)顯著下調(diào)，說(shuō)明細(xì)胞自噬水平明顯下降，經(jīng)CPCGI治療可劑量依賴地恢復(fù)Beclin1表達(dá)，使細(xì)胞恢復(fù)自噬能力。

線粒體選擇性自噬機(jī)制的PINK1/Parkin通路在清除受損線粒體過(guò)程中也發(fā)揮重要作用［19-22］。正常情況下，PINK1表達(dá)于所有線粒體上，并由蛋白水解酶降解；而受損的線粒體由于蛋白水解酶活性被抑制，PINK1會(huì)持續(xù)累積［23］。本研究顯示，模型組大腦皮層組織中PINK1的表達(dá)顯著升高，說(shuō)明線粒體自噬功能障礙，CPCGI治療可逆轉(zhuǎn)這一變化。此外，Parkin參與的泛素蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)于體內(nèi)毒素和代謝物的清除以及細(xì)胞修復(fù)起到重要作用［24-25］。本研究顯示，模型組大腦皮層組織中Parkin蛋白表達(dá)降低，CPCGI則可以逆轉(zhuǎn)該損傷，激活線粒體自噬，有利于清除受損線粒體，保護(hù)正常線粒體功能，從而改善缺血再灌注損傷。

綜上所述，CPCGI對(duì)急性腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能、感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)功能均有較好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制之一可能是通過(guò)激活線粒體自噬功能發(fā)揮的。詳細(xì)作用機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。

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Effect of Compound Porcine Cerebroside and Ganglioside Injection on Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in Rats

WANG Ming-yang，F(xiàn)ENG Lu，F(xiàn)AN Shu-jie，ZHENG Ji，LI Dong-mei，YANG Nan，ZUO Ping-ping，LIU Yan-yong
Department of Pharmacology，Institute of Basic Medical Sciences，Neuroscience Center，Chinese Academy of Medical Sciences&School of Basic Medicine，Peking Union Medical College，Beijing 100005，China
Correspondence to LIU Yan-yong.E-mail:liuyanyong@126.com

Objective To investigate the neuroprotective effect and possible mechanism of Compound Porcine Cerebroside and Ganglioside Injection（CPCGI）on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.Methods Healthy adult male Sprague-Dawley rats were divided into sham group（n=10），model group（n=10），CPCGI low dosage group（n=10）and high dosage group（n=10），and control group（Ginkgo biloba extract，n=10）.All the rats was subjected to middle cerebral artery occlusion（MCAO）for two hours and reperfusion except sham group，and received treatment for fourteen days once reperfusion started.They were tested with modified Neurological Severity Score one，three，seven and fourteen days after MCAO，and adhesive-removal test and beam-walking test fourteen days after MCAO.The expression of Beclin1，PINK1 and Parkin were detected with Western blotting.Results Compared with the model group，the Neurological Severity Score reduced （P＜0.05）and the time crossing the beam reduced（P＜0.01）in all the medical groups fourteen days after MCAO，and the time removing the adhesive paper reduced in the CPCGI groups（P＜0.01）.The expression of Beclin1 and Parkin decreased and the PINK1 level increased in the model group（P＜0.01），and it was reversed in all the CPCGI groups（P＜0.05）.Conclusion CPCGI could relieve the cerebral ischemia-reperfusion injury in rats through the regulation in mitophagy.

cerebral ischemia-reperfusion injury；Compound Porcine Cerebroside and Ganglioside Injection；mitophagy；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.002

R743.32

A

1006-9771（2016）07-0750-04

北京協(xié)和青年基金（No.3332015113）。

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥理室，北京市100005。作者簡(jiǎn)介：王明洋（1990-），女，漢族，河南新密市人，博士研究生，主要研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)。通訊作者：劉雁勇（1972-），男，博士，研究員，主要研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)。E-mail:liuyanyong@126.com。

2016-03-01

2016-03-18）