力竭運動對大鼠腎臟的影響①

陳麗娜，周剛，吳樂，梅雨

力竭運動對大鼠腎臟的影響①

陳麗娜，周剛，吳樂，梅雨

目的觀察力竭運動對大鼠腎臟的影響及其機制。方法雄性Sprague-Dawley大鼠14只分為對照組（C組，n=7）和力竭運動組（E組，n=7）。測量定運動后大鼠尿蛋白、尿酸、葡萄糖，血尿素氮；熒光探針法檢測腎臟活性氧物質（ROS），Western blotting檢測腎臟誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、硝基酪氨酸（3-NT）和nephrin蛋白含量；Harris染色觀察腎組織形態變化。結果E組大鼠尿蛋白、尿酸、葡萄糖，血尿素氮，及腎ROS、iNOS、3-NT和nephrin蛋白含量均與對照組有顯著性差異（P＜0.05），腎小球形態改變，毛細血管基底膜增厚變形。結論力竭運動可通過氧化應激機制，導致腎組織結構損傷。

力竭運動；腎；活性氧物質；nephrin；大鼠

［本文著錄格式］陳麗娜，周剛，吳樂，等.力竭運動對大鼠腎臟的影響［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（7）:789-792.

CITED AS:Chen LN，Zhou G，Wu L，et al.Effect of exhaustive exercise on kidney in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（7）:789-792.

足細胞（pedocyte）是維持腎小球濾過屏障結構和功能正常的主要細胞之一。足細胞足突緊鄰腎小球基底膜的裂孔隔膜，裂孔隔膜是腎小球濾過屏障通透性的關鍵屏障，裂孔蛋白與蛋白尿的產生密切相關［1］。nephrin是維持足細胞結構和功能的主要裂孔隔膜蛋白，nephrin缺乏可導致裂孔膜喪失。

目前對于病理性nephrin異常導致蛋白尿增加已有很多研究。本研究觀察大鼠力竭運動后腎組織腎小球細胞變化及nephrin蛋白表達。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組

PSF級雄性Sprague-Dawley大鼠14只，體質量240～260 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2011-0003。分籠飼養，每籠3～4只，飼養溫度20～25℃，自由進食、飲水，自然晝夜光照。

大鼠正常飼養3 d后，按隨機數字表法分為安靜對照組（C組）和力竭運動組（E組），每組7只。

1.2運動方案

E組采用中等強度力竭跑臺運動［2］。采用ZH-PT跑臺（淮北正華生物儀器設備有限公司），先進行適應性運動3 d，速度5 m/min，無坡度，每天1次。正式運動3 d，從20 m/min、坡度5%、5 min開始，逐漸增加至24 m/min、坡度10%，直到力竭。運動過程用電刺激進行強迫，刺激強度＜1 mA。觀察到大鼠汗毛豎起，四肢癱軟，眼神無光，翻轉后無法進行翻正反射，電刺激無法繼續運動即為達到力竭狀態。運動時間多為120～150 min。

1.3樣本的采集與處理

正式運動前2 d，運動后將大鼠置于代謝籠6 h禁食，收集尿液，檢測尿蛋白、尿糖、尿酸。最后一次力竭運動后立刻取樣。

1.3.1血液

末次運動后，大鼠立即腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg，待大鼠出現四肢無力、昏迷、心跳緩慢，掐尾部無反應時取出。固定大鼠四肢，迅速自腹部向上剪開胸腔，暴露心臟，5 ml一次性無菌注射器左心室取血，立刻測定血尿素氮、血糖。

1.3.2尿樣

前2次正式運動后置于代謝籠中禁食6 h，收集尿液，檢測尿糖、尿酸。末次運動取血后用微量注射器抽取膀胱尿液，分裝于試管中，檢測尿蛋白。

1.3.3腎組織

迅速取出兩側腎臟，冰上去除脂肪及結締組織，生理鹽水沖洗余血，濾紙吸干。左腎置于1.5 ml離心管，-20℃保存，以備制作顯微鏡切片；右腎立即密封放入-158℃液氮中冷凍，取出后保存在-80℃超低溫冰箱中以備勻漿。

稱取右腎組織1 g左右冰上剪碎。每mg組織加入PBS勻漿液（pH=7.4，含5 mmol/L磷酸、250 mmol/L蔗糖、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L苯甲基磺酰氟和1 mmol/L二硫蘇糖醇）10 μl，勻漿后分裝兩個離心管，一管以3000 r/min離心10 min，取上清液分裝后-80℃保存，用于活性氧物質（reactive oxygen species，ROS）、蛋白定量測定；另一管以12，000 r/min離心25 min，取上清液分裝-80℃保存，用于誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、硝基酪氨酸（nitrotyrosine，3-NT）、nephrin測定。

1.4測量

1.4.1血尿生化

尿蛋白、尿素氮、尿酸試劑盒購于南京建成生物工程研究所，葡萄糖試劑盒購于上海榮盛生物藥業有限公司。常規測定。

1.4.2ROS

采用DCFH-DA熒光探針檢測［3］。試劑購于碧云天生物技術研究所。96孔板中測定孔每孔加入腎組織勻漿液200 μl和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）100 μm，對照孔加入等量超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及DCFH-DA 10μm，混勻，37℃恒溫孵育30 min，多功能酶標儀檢測，激發波長485 nm，發射波長525 nm。

1.4.3iNOS、3-NT、nephrin

采用Western blotting法，以磷酸甘油醛脫氫酶（glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenas，GAPDH）為內參。GAPDH抗體購于杭州賢至生物科技有限公司，iNOS、nephrin抗體購于武漢博士德生物工程有限公司，3-NT抗體購于美國SIGMA-ALDRICH公司。

腎組織蛋白定量采用BCA蛋白濃度測定法，試劑盒購于碧云天生物技術研究所。

采用ImageJ 1.43b軟件計算灰度值。

1.4.4腎組織形態

剪取左腎組織2.5～3.5 mm，除去多余組織及脂肪，置于樣品托，OCT包埋，PE鍵迅速冷凍，CM1850冷凍切片機切片，厚0.5μm。常規Harris染色，甲醛固定2 min，二甲苯透明10 min，無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇逐級脫水1 min，Harris蘇木紫染色10 min，1%酸性酒精脫色15 s，10× 40光學顯微鏡下觀察，攝片。

1.5統計學分析

2結果

2.1血尿生化

與C組比較，E組尿糖、尿液尿酸升高（P＜0.05），尿蛋白、血尿素氮明顯升高（P＜0.01），血糖顯著降低（P＜0.001）。見表1。

2.2ROS

E組大鼠腎ROS較C組升高近5倍（P＜0.01）。見表1。

表1　　各組生化及蛋白表達比較

2.3iNOS、3-NT、nephrin

E組iNOS明顯升高（P＜0.01），3-NT含量明顯增加（P＜0.01），nephrin表達降低（P＜0.05）。

2.4形態學觀察

C組腎小球形態正常均勻，排列規則。E組腎小球球體肥大，分布減少；毛細血管基底膜增厚，系膜基質增生。見圖1。

圖1　各組大鼠腎組織形態變化（Harris染色，400×）

3討論

腎小球濾過屏障主要由三層結構組成，由內向外分別為毛細血管內皮細胞、腎小球基底膜以及足細胞。腎小球濾過膜中限制血漿蛋白通過的部位主要為腎小球基底膜和臟層上皮細胞，其中腎小球足細胞及其足突的裂孔隔膜是腎小球的最后一道濾過屏障，并起關鍵作用。裂孔隔膜的完整性是決定腎小球濾過屏障通透性的關鍵屏障，而裂孔隔膜上的裂孔蛋白與蛋白尿的發生密切相關［4］。近年關于足細胞裂孔蛋白的研究越來越受到重視，先后發現了nephrin、podocin、CD2相關蛋白等蛋白分子。其中nephrin在維持足細胞形態和足突裂孔隔膜的結構和功能中起重要作用；nephrin表達變化也是蛋白尿生成的一個重要因素［5］。

已有研究表明，劇烈運動時血液重新分配，骨骼肌血流量增加，腎臟血流量降低。腎血流量減少導致腎小球濾過膜和近曲小管出現缺血性改變。扈詩興等發現，長期有氧訓練可致腎組織濾過屏障產生適應性變化，適應增強腎臟功能；而過度訓練使有孔內皮變薄，足細胞足突融合成片，濾過屏障面積減小，形態結構受損［6］。在糖尿病腎病模型中，足細胞相關蛋白表達異常可導致足細胞結構和功能的變化，而nephrin是足細胞損傷的早期標志。FoxO1表達上調可以提高PCX、nephrin和desmin表達，并減少糖尿病大鼠腎小球足細胞損傷［7］。

運動性蛋白尿是腎功能不全的早期表現。運動后尿蛋白量可以作為評定運動員身體狀態和運動負荷的指標。力竭運動，體內糖原迅速消耗，腎小管重吸收功能下降，葡萄糖隨尿排出，而血糖迅速降低。鄭偉華等認為，運動訓練后尿蛋白、尿酸陽性更容易阻塞腎小管，引起腎內梗阻，而導致運動性腎損害發生［8］。均與本研究結果一致。

NADPH氧化酶大量表達于腎血管、腎小球系膜、足細胞致密斑、后升支段、遠端小管和集合管內。生理狀態下，NADPH氧化酶活性很低；而在各種生長因子、細胞因子、高血糖和脂質代謝障礙的刺激下，NADPH氧化酶活性升高，導致氧化應激，產生ROS。ROS屬于活性高的自由基，極不穩定，可通過脂質過氧化作用造成嚴重損害［9］。

ONOO-是酪氨酸硝基化形成的終末產物，是蛋白質硝基化的特異性標志物，是氧化應激損傷的重要性環節［10］。由于ONOO-在體內的半衰期極短，研究中通常采用其反應物3-NT來替代。

本實驗室前期研究已發現，力竭運動可致ROS生成增加，NADPH氧化酶抑制劑可明顯減少ROS的生成，從而減少ONOO-的生成。本研究同樣檢測到力竭運動后大鼠ROS明顯增加；同時大鼠腎組織iNOS、3-NT生成明顯增加。提示力竭運動可增加腎組織NADPH氧化酶活性，產生O2-，并與iNOS催化生成的NO反應，產生大量的ONOO-。

有研究認為，NADPH氧化酶4（NOX4）衍生的ROS增加在足細胞中起至關重要的作用，并在糖尿病患者的蛋白尿變化中至關重要。糖尿病誘導nephrin表達減少，足細胞損傷，與糖尿病型蛋白尿相關［11］。ROS通過增強NADPH氧化酶依賴的超氧陰離子生成，增加細胞色素P450 4A家族（CYP4A）和NADPH氧化酶表達，在糖尿病型足細胞損傷和蛋白尿的生成中發揮重要作用［12］。Whaley-Connell認為，NADPH氧化酶活性增加，導致ONOO-生成增加，ONOO-形成穩定的3-NT共軛分子，伴隨腎小球纖維化過程［13］。林喜秀等電鏡觀察發現，急性力竭運動后，腎小球內皮細胞腫脹、成對，胞質連拱狀，基膜扭曲塌陷，足細胞胞體脫落，足突融合并出現變異，分布減少，濾過屏障結構破壞明顯［14］。可能與NOS的缺乏或過多表達有關。

本研究顯示，力竭運動致nephrin蛋白表達減少，ROS、iNOS增加，導致ONOO-生成增加，造成腎濾過屏障破壞，與運動性蛋白尿的生成密切相關。

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Effect of Exhaustive Exercise on Kidney in Rats

CHEN Li-na，ZHOU Gang，WU Le，MEI Yu
College of Sport，Hunan University，Changsha，Hunan 410082，China
Correspondence to ZHOU Gang.E-mail:zg460@126.com

Objective To observe the effect of exhaustive exercise on the function of the kidney in rats and explore the mechanism. Methods Fourteen male Sprague-Dawley rats were divided into sedentary control group（group C）and exhaustive exercise group（group E）. They were measured the urine protein，uric acid，glucose，and blood urea nitrogen after exercise.The reactive oxygen species，inducible nitric oxide synthase，nitro tyrosine in kidney，and nephrin protein in the kidney were detected with fluorescent probe and Western blotting，respectively，and observed under Harris staining.Results There were significant differences between groups C and E in urine protein，uric acid，glucose，blood urea nitrogen，reactive oxygen species，inducible nitric oxide synthase，nitrotyrosine and nephrin protein（P＜0.05）.The glomerular morphology and the deformation of capillary basement membrane were found under the fluorescence microscope in group E. Conclusion Exhaustive exercise may damage the structure of kidney in rats，which may associate with oxidative stress.

exhaustive exercise；kidney；reactive oxygen species；nephrin；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.010

R873

A

1006-9771（2016）07-0789-04

湖南省自然科學基金項目（No.12JJ3093）。

湖南大學體育學院，湖南長沙市410082。作者簡介：陳麗娜（1990-），女，漢族，河南商城縣人，碩士研究生，主要研究方向：運動氧應激。通訊作者：周剛，男，博士，副教授。E-mail:zg460@126.com。

2016-01-29

2016-03-14）