一株產紅色素的絲枝蠟蚧霉新菌株

董　旋，曾桂萍，陳萬浩，韓燕峰，梁宗琦

(貴州大學 生命科學學院真菌資源研究所，貴州 貴陽 550025)

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一株產紅色素的絲枝蠟蚧霉新菌株

董旋，曾桂萍，陳萬浩，韓燕峰*，梁宗琦

(貴州大學 生命科學學院真菌資源研究所，貴州 貴陽 550025)

為了對我國西部地區土壤中稀有且重要的真菌資源進行調查，采用經典形態學及分子系統學方法相結合，對獲得的菌株進行鑒定。從西藏采集的樣品中分離獲得一株蠟蚧霉GZUIFR.SP477菌株，其主要特征是：菌落白色，背面鮮紅色；分生孢子梗上僅2-3個瓶梗著生，大多數瓶梗直接著生于菌絲上，單生、對生至輪生；瓶梗橢圓形至柱狀，(5.5-10)μm×(1.5-1.8)μm；分生孢子卵圓至長橢圓形，(2.5-6.0)μm×(1.8-2.2)μm，呈短鏈。基于形態學及分子系統學方法相結合鑒定，蠟蚧霉GZUIFR.SP477菌株為我國一新記錄種，絲枝蠟蚧霉LecanicilliumaphanocladiiZare & W. Gams。

無性型真菌；絲狀真菌；分類鑒定

蠟蚧霉屬LecanicilliumW. Gams & Zare 隸屬于子囊菌門(Ascomycota)，肉座菌目(Hypocreales)，蟲草菌科(Cordycipitaceae)。基于rDNA ITS、大亞基及小亞基的序列分析，以Lecanicilliumlecanii(Zimm.) Zare & W. Gams為模式種，Zare & Gams[1]將輪枝孢屬VerticilliumNess 中那些分生孢子排列呈單疊瓦狀或常形成粘孢團的蟲生種移入了新屬蠟蚧霉屬，有性型為Torrubiella和Cordyceps。目前，該屬包含24個種(http://www.indexfungorum.

org/Names/Names.asp)，其主要屬征為：分生孢子梗通常著生于氣生菌絲上，其上著生一至幾個瓶梗輪生體；瓶梗比較離散，向上突然變為很細的頸部；分生孢子大多單生，粘結成頭狀或成鏈，大多橢圓形。大多數種屬于蟲生真菌或真菌寄生菌。國內對該屬的分類研究報道較少，僅見有名錄，未進行詳細分類描述及鑒定。如謝占玲等[2]對青海湖耐鹽真菌調查時曾分離到L.aphanocladii，苘娜娜等[3]從浙江省蠶區的病蠶或病蛹中也曾分離到L.attenuatum，L.saksenae和L.aphanocladii。

由于廣泛用于食品、化妝品、和醫藥中的很多人工合成的著色劑具有嚴重的安全問題，從天然資源發展色素的生產已引起全球的關注。目前已授權天然食品著色劑多是來源于植物和動物，但它們有不少缺點，如對光、熱、或不利的pH值不穩定，水溶性低，褪色快。從真菌中尋找天然色素倍受人們關注。已知能獲得高產色素的真菌多屬于紅曲，青霉，擬青霉Paecilomycessenulato和蟲草Cordycepssenulato屬中的一些種[4-5]。

近年，作者在西藏地區做土壤真菌資源調查時，新分離到一種在人工培養基上能產生鮮明紅色素的蠟蚧霉屬菌株Lecanicilliumsp.。本文將對該菌株進行描述、圖解及分子系統學分析。

1　材料與方法

1.1菌株的分離

參照韓燕峰等[6-7]從土壤中分離真菌的方法進行。菌株GZUIFR-SP477分離自西藏自治區拉孜縣的一麥田土樣。

1.2菌種的形態學描述

形態學參照Zare R & Gams W.[1]文獻進行。采用常規查氏培養基和PDA培養基[6]在40℃下恒溫培養7 d，觀察記載菌落特征并用顯微鏡對菌株的微觀產孢結構進行測量和拍照，然后進行形態學鑒定。

1.3DNA提取及PCR擴增

參照韓燕峰等[4]的操作方法，采用DNA提取試劑盒提取總DNA，用通用引物ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5 (5′-GGTGAGAGATTTCTGTGC-3′)對ITS1-5.8S-ITS2 rDNA進行PCR擴增。擴增體系選用25 μL反應體系，包括引物ITS4 1 μL，ITS5 1 μL，2×Master Mix 12.5 μL，模板2 μL，無菌水補足25 μL。PCR條件為：94℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 5 min。將獲得的PCR產物交北京諾賽公司進行測序，得到的序列經校正后提交(GenBank KX021371)。

1.4數據處理和系統發育樹的構建

從GenBank中下載蠟蚧霉屬種的序列共48條，所用的序列信息如菌名、菌株號和登錄號見圖2，以Simplicilliumlanosoniveum(J.F.H. Beyma) Zare & W. Gams的ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列為外群，用ClustalX 1.83進行序列比對，手工校正后，用Mrbayes 3.1.2，經1 000次Bootstrap驗證，構建系統發育樹[8]。

2　結果與分析

2.1形態描述

絲枝蠟蚧霉(圖1)

LecanicilliumaphanocladiiZare & W. Gams，NovaHedwigia. 73(1-2): 27 (2001)

=AcremoniumaranearumPetch，Trans.Br.mycol.Soc. 16(4): 242 (1932) (1931)

PDA培養基上，25℃，14 d，菌落直徑大約41 mm，絨毛狀，白色，背面鮮紅色；菌絲寬1.2-1.5 μm，有隔；分生孢子梗直立，原瓶梗(prophialid)少，僅2-3個瓶梗著生其上，大多數瓶梗直接著生于菌絲上，單生、對生至輪生。瓶梗橢圓形至柱狀，(5.5-10)μm×(1.5-1.8)μm；分生孢子長卵圓至橢圓形，(4.5-6.0)μm×(1.8-2.2)μm，呈短鏈。

研究菌株：GZUIFR.SP477，現保存于貴州大學真菌資源研究所(GZAC)。

產地：西藏，拉孜，麥田土樣。

圖1　蠟蚧絲枝霉GZUIFR.SP477菌株

2.2分子鑒定

采用Mrbayes法構建的系統發育樹顯示(圖2)，所用的蠟蚧霉屬各種的不同菌株能很好的區分。L.kalimantanense與L.wallacei以97%的支持率聚為一支；L.fungicola以99%的支持率聚為一亞支；L.aranearum菌株以96%的支持率聚為一支；L.primulinum以92%的支持率聚在一起；L.psalliotae以83%的支持率聚為一亞支；5株L.attenuatum、3株L.lecanii和2株L.muscarium都能各自聚為一亞支；L.sabanense、L.longisporium與L.nodulosum以84%的支持率聚為一亞支；四株聚為一亞支的L.saksenae與L.aphanocladii以96%的支持率聚為一分支；其中菌株GZUIFR.SP477與絲枝蠟蚧霉L.aphanocladii以97%，并與其余蠟蚧霉種明顯區分。

3　結論與討論

目前蠟蚧霉屬報道的有效種有26種，菌株GZUIFR.SP477的形態描述在菌落顏色、分生孢子梗和孢子形態等方面與R.Zare & W.Gams[1]的描述基本一致(表 1)。

圖2　基于ITS-5.8S rDNA序列，采用Mrbayes法構建的蠟蚧霉屬菌株的系統發育關系

Fig.2Relationships inferred fromMrbayes analysis ofLecanicilliumspecies based on ITS-5.8S rDNA sequences. Numbers above branches indicate posterior probabilities in Bayesian analyses after 10，000，000 generations.Simplicilliumlanosoniveumwas used as outgroup

表1　菌株GZUIFR.SP477與蠟蚧絲枝霉形態特征比較

基于ITS-5.8S rDNA序列，采用Mrbayes 法對菌株GZUIFR.SP477與Lecanicillium中其余種構建的系統發育樹表明，該屬為單源發生，這與R.Zare & W.Gams[1]采用ITS、大亞基及小亞基共3個rDNA基因序列獲得的系統發育結果一致，說明ITS-5.8S rDNA序列可以作為該屬分種的依據。同時經綜合形態特征和分子系統學分析，菌株GZUIFR.SP477應鑒定為絲枝蠟蚧霉LecanicilliumaphanocladiiZare & W. Gams。

真菌能形成化學穩定性高、化學結構及色調多樣的色素，例如能合成和分泌各種醌類、酸類、酮類以及一些含氮化合物色素[9]。目前，已獲得高產色素的主要真菌類群有紅曲霉、青霉、擬青霉和蟲草[10]中的一些種。其中，一些不產毒素的青霉，如產紫青霉(P.purpurogenumFleroff)等研究報道較多[11-12]。Gunasekaran & Poorniammal[4]報道了一個產蒽醌類紅色素的青霉新菌株。此菌產生的色素可用于食品和化妝品，通過優化培養條件，紅色素的產量提高了7倍。現本文報道一株產紅色素的新菌株，以期為天然紅色素在食品和化妝品等領域的應用提供新資源。

[1]Zare R，Gams W. A revision ofVerticilliumsect.ProstrataIV. The genusLecanicilliumandSimplicilliumgen.nov.[J].NovaHedwigia，2001(73): 1-50.

[2]謝占玲，王歡，趙朋，等. 分離自青海湖可培養耐鹽真菌的多樣性研究[J].菌物學報，2012，31(2): 187-195.

[3]苘娜娜，馬煥燕，魯華云，等. 不同分子類型家蠶病原性白僵菌的分離及致病性試驗[J].中國蠶葉，2015，36(3): 32-37.

[4]GUNASEKARAN S，POORNIAMMAL R. Optimization of fermentation conditions for red pigment production fromPenicilliumsp. under submerged cultivation[J].AfricanJournalofBiotechnology，2008，7 (12): 1894-1898.

[5]MAPARI AS，THRANE U，MEYER AS. Fungal polyketideazaphilone pigments as future natural food colorants? [J].TrendsinBiotechnology， 2010，28(6): 300-307.

[6]HAN YF，WANG YR，LIANG JD，etal. A new species of the genusChrysosporiumfrom the farmland soil of Qinghai Province[J].Mycosystema，2013，32(4): 606-611.

[7]韓燕峰，王玉榮，梁建東，等. 來自青海農田土壤的金孢屬一新種[J].菌物學報，2013，32(4): 606-611.

[8]CHIRIVI-SALOMON JS，DANIES G，RESTREPO S，etal.Lecanicilliumsabanensesp. nov. (Cordycipitaceae) a new fungal entomopathogen of coccids [J].Phytotaxa，2015，234(1):63-74.

[9]PASTRE RMA，RODRIGUES-FILHO E，SOUZA AQL，etal. Diversity of polyketides produced byPenicilliumspecies isolated from Media azedarach and Murrayapaniculata [J].QuimNova，2007，30(8): 1867-1871.

[10]韓燕峰，梁建東，梁宗琦，等. 培養基成份對雙梭孢蟲草色素形成的影響[J].貴州農業科學，2011，39(11): 95-98.

[11]張馨，曹紅，李春，等. 產紫青霉菌的發酵條件及色素穩定性、安全性的研究[J].中國食品添加劑，2016，68(2): 68-74.

[12]劉維，阮璐雅，管成林，等. 一株鐵皮石斛內生真菌H1B1產紅色素穩定性的研究[J].中國食品添加劑，2016，68(1)71-75.

A new fungus strain (producing red pigment) ofLecanicilliumaphanocladii

DONGXuan,ZENGGui-Ping,CHENWan-Hao,HANYan-Feng*,LIANGZong-Qi

(InstituteofFungusResources,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

The objectives of the study were to investigate and discover some rare and important fungi from the soil in the western China. Fungus strains were isolated and identified by the classical morphological characters and molecular systematics. Strain GZUIFR.SP477 from Xizang autonomous region was discovered. The main characteristics of this strain were as follows: colony white, dorsal surface obviously bright red; only 2-4 phialides produced from the conidiophore, most phialides directly from the mycelium, solitary, opposite and in whorls, ellipsoid to cylindrical, (5.5-10)μm×(1.5-1.8)μm; conidia oval to long ellipsoid, (2.5-6.0) μm×1.8-2.2 μm, sometimes on short chains. It is concluded that strain GZUIFR.SP477, based on the morphological characters and molecular systematics, is a new strain, which produces red pigment, of Lecanicillium aphanocladii Zare & W. Gams, a new record for the species in China.

Anamorphic fungi, Filamentous fungi, Taxonomy and identification,Lecanicilliumaphanocladii

1008-0457(2016)03-0091-04國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.03.018

2016-04-07；修回日期：2016-05-17

科技部基礎專項項目子項目“金孢及近似4屬志的研編”(No. 2013FY110400)；國家自然科學基金項目“廣義擬青霉屬的系統發育及支序的分類地位研究”(No. 31460010)；貴州省優秀青年科技人才培養對象專項資金項目“中國西南地區戴氏霉屬真菌資源系統學及其對秸稈降解利用的前期研究”(No. 2013-05)。

韓燕峰(1978-)，博士，教授，主要研究方向：真菌資源系統發育及其利用價值研究；E-mail：swallow1128@126.com。

Q939.9

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