對平板劃線操作技術的幾點思考

楊鳳華

(江蘇省口岸中學 225321)

人教版高中生物學教材選修1中介紹了用平板劃線法純化大腸桿菌。以下是對該實驗在教學過程中遇到的幾個問題的思考。

1 為什么在操作的每一步前后都要灼燒接種環

操作開始時灼燒接種環，是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養物；每次劃線之前灼燒接種環，是為了殺死上次劃線結束后接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時接種環上的菌種直接來自上次劃線的末端，通過劃線次數的增加而使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落；劃線結束后灼燒接種環，及時殺死接種環上殘留的菌種，防止污染環境和感染操作者。

2 如何讓初學者在劃線無痕的平板上確定5個區域

由于平板冷卻凝固之后，是倒過來放置的，正好使得皿蓋在下皿底在上。可以在皿底的背面用記號筆將平板分成面積不等的5個小區域(圖1)，第1區面積最小，作為待分離菌的菌源區；第2、3、4區是逐級稀釋的過渡區；第5區則是關鍵區，通過劃線操作使該區出現大量的單菌落以供挑選純種用。平板上5個區面積的分配應是5>4>3>2>1。待到劃線接種時，操作者就可以將接種環沿著記號的順序和位置進行劃線，這樣既能保證第2、3、4、5次劃線都是從上一區域的末端開始，而且第5區域和第1區域不相連，又能便于充分利用整個平板的面積，得到較多的典型單菌落。

圖1 平板劃線的5個區域

3 為什么要將平板倒置放入培養箱中培養

①倒置培養能很大程度減少外來微生物的侵染；②培養過程中產生的水蒸氣不會停留在皿蓋上而影響觀察，因為若培養皿正放進行溫育(例如，37℃或是更高的溫度)，培養基中的水分蒸發遇皿蓋冷凝后會滴回培養基表面，進而影響菌落的分布；③培養皿倒置后，在重力的作用下，菌落生長比較集中，不會蔓延得太快，更容易得到單菌落；④在用強制通風的培養箱里，倒置平板可以減少培養基表面的空氣流動，使培養基水分蒸發減慢，水分不易流失，防止培養基斷裂。

4 如何界定平板劃線技術是否合格

培養24h后觀察平板，①平板應無雜菌污染；②劃線應為直的，且每一線都接近平板邊緣，平行的線和線之間要緊密，但不能搭在一起；③要有較多的單菌落，至少應有10個以上的單菌落方為合格。

圖1 CRISPR/Cas系統示意圖

1.2 細菌的獲得性免疫 當外源DNA侵入細菌細胞時，CRISPR/Cas復合體識別入侵DNA中的原間隔序列附近的毗鄰基序(PAM)，將外源DNA片段的原間隔序列剪切成間隔序列，并整合進兩個重復序列之間，形成記憶[2]。

當細菌第二次受到相同外源DNA入侵時，CRISPR 基因座首先被轉錄成前體 CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在 Cas9蛋白和核酸內切酶Ⅲ的作用下被剪切成一些小的RNA 單元，這些小RNA即為成熟的crRNA，它由一個間隔序列和其兩側的重復序列組成。然后crRNA和tracrRNA結合，形成tracrRNA∶crRNA復合分子，并在Cas9蛋白的協助下，使原間隔序列與crRNA序列配對，由此識別出外源DNA的PAM序列。同時，Cas9蛋白發揮核酸酶的功能，將入侵的外源DNA分子剪切掉。而細菌自身的間隔序列，由于沒有PAM序列，因而不會被剪切掉[3]。由此可見，原核生物的這種防衛外源DNA的方式，類似于人體內的獲得性免疫：CRISPR/Cas系統賦予了原核生物對外源DNA的記憶性和特異性。

外來的間隔序列是高度可變的，不同的間隔序列代表入侵的不同外源DNA，可以是病毒的，也可以是質粒或其他外源DNA分子。

2 CRISPR/Cas基因編輯技術及其應用

從上述CRISPR/Cas 系統的作用原理可以看出，CRISPR/Cas 系統與限制性核酸內切酶相似，它對序列的特異性切割主要依賴于crRNA 與 Cas 蛋白形成的核糖核蛋白復合物識別靶序列上的PAM以及原間隔序列。根據這一特性，科學家將其設計成人工的限制酶，用以對感興趣的基因位點進行切割修飾。目前發現的3類CRISPR/Cas系統中，Ⅱ型系統的核糖核蛋白復合物相對簡單，除 crRNA 和 tracrRNA 外，只有一個Cas9蛋白。

要實現CRISPR/Cas9系統對真核生物基因組的定點修飾，只需要滿足兩個條件：一個Cas9蛋白，一條向導RNA(gRNA)。向導RNA由兩部分組成：一段約20個堿基的RNA片段(相當于crRNA)，此片段可以和定點修飾的靶標基因配對；另一段為60個堿基的RNA片段(相當于tracrRNA)，此片段對激活Cas9蛋白是必需的。針對要修飾的靶標基因(如某種致病基因)，設計好crRNA的序列，然后將Cas9基因和gRNA基因重組到質粒中，將重組質粒導入受體細胞內，就能實現對特定靶標基因的修飾改造[3]。

Cas9:gRNA核糖核蛋白復合體相當于人工限制性核酸內切酶，只不過其特異性切割的靶標序列可以人為地設計。當受體細胞的靶標序列被切開后，會激活細胞內的DNA修復機制，通過精確的同源重組修復機制或非同源重組的末端連接修復機制，就能實現外源正常基因的定點插入，從而達到替換致病基因的目的[2]。

CRISPR/cas9基因編輯技術誕生于2013年，與之前的基因定點編輯技術(ZFNs技術和TALENs技術)相比，CRISPR/cas9基因編輯技術有準確性高，脫靶率低的特點，而且技術要求簡單，容易操作[3]，費用也很低。這項技術的出現，堪比基因測序技術、DNA重組技術、PCR擴增等分子生物學技術，必定具有劃時代的意義。

目前，CRISPR/Cas基因編輯技術已經在釀酒酵母、擬南芥、小鼠等多種模式生物中應用，實現了對目的基因組DNA的編輯。2014年年初，我國學者黃行許等人利用該技術對獼猴胚胎細胞進行基因編輯，獲得兩只嵌合的“基因編輯猴”。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術涉及的倫理問題

Cas9蛋白識別的PAM序列(5′-AGG-3′)在人類基因組中平均每8個堿基就會出現一個。從理論上說，任何一個基因都可以通過CRISPR/Cas9進行編輯改造，包括對人類生殖細胞的基因進行編輯。例如，針對某些單基因遺傳病，用這項技術對生殖細胞中的致病基因進行編輯改造，以便一勞永逸地解決某些家族遺傳病。

2015年3月，我國中山大學的研究小組利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對人類胚胎中導致β型地中海貧血癥的基因進行修飾。他們針對致病基因設計和生成了3個gRNA，并將其與CRISPR/Cas9基因一起重組進表達載體中，然后注入收集到的86個三原核胚胎(此為人工授精過程中出現異常的不能夠正常發育的三倍體胚胎)，結果獲得71個存活胚胎，并對其中的54個進行遺傳檢測，檢測結果顯示：有28個獲得了成功的剪切[4]。這是人類首次對自身胚胎進行基因編輯的嘗試。該研究論文被《Nature》和《Science》退稿，但最終在線發表于國內英文學術期刊《Protein & Cell》上。令人意想不到的是，這篇論文發表后在學術界引發了巨大的倫理爭議。國內許多生物學家對此給予極力的肯定，但遭到國外多數同行的強烈指責。全世界近20個國家立法禁止改造生殖細胞的基因，而我國還沒有相關的法律限制；國內的許多學者認為，我們要乘西方國家在這方面的倫理限制，抓住機遇，搶占人類基因編輯研究的制高點；哈佛大學干細胞研究專家George Daley也贊同此項研究：“這是CRISPR/Cas9技術應用于人體胚胎細胞基因修飾的一個里程碑式的研究，它向人們顯示了未來在根除致病基因方面具備的潛力” 。但美國再生醫學聯盟主席Edward Lanphier和CRISPR/Cas9技術發明者之一的Jennifer Doudna等不少學者都表示，應禁止該技術應用于人類生殖細胞基因的改造；美國國立衛生研究院院長也聲明這是“不可逾越的紅線”。2015年5月18日，美國國家科學院和美國國家醫學院宣布，將發起一項重要的倡議，為編輯人類基因組制定指導性規范。

人類生殖細胞的基因編輯技術目前還處于初級階段，CRISPR/Cas9基因編輯技術比起以前的兩項基因定點編輯技術(ZFNs技術和TALENs技術)來說，編輯的準確率已經有了很大的提高，但還不能達到100%。要實現人類生殖細胞的編輯，一定要達到100%的準確率。但是，即使達到了100%的準確率，就可以肆無忌憚地對人類基因進行編輯嗎？改造人類生殖細胞的基因必然涉及以下幾個問題：①被改造的基因和其他基因的關系搞清楚了嗎？改造某個基因，產生的影響有多大？②這種改造是不可逆的，而且會隨著生殖而遺傳，一旦出現了不合適的改造，如何來糾錯？③致病基因可以被改造，那么其他諸如高矮、胖瘦、聰明等基因呢？能否被改造？④改造必然影響人類基因的多樣性，這會影響人類的進化嗎？ 隨著基因編輯技術的日趨成熟，這些問題值得人們深思。