硫化氫在ob/ob小鼠皮膚創面愈合中的作用與調控機制*

趙蕙琛， 柴家超， 鄭 杰， 王媛妹， 王園園， 郭秀芝， 管慶波， 劉元濤

(山東大學第二醫院1內分泌科，4心內科，5腎內科，山東濟南250033;2青島市立醫院內分泌科，山東青島266071;山東大學附屬省立醫院3兒外科，7內分泌科，山東濟南250021;6泰安市中心醫院分院職二科，山東泰安271000)

硫化氫在ob/ob小鼠皮膚創面愈合中的作用與調控機制*

趙蕙琛1，2， 柴家超3， 鄭 杰4， 王媛妹1， 王園園5， 郭秀芝6， 管慶波7△， 劉元濤2△

(山東大學第二醫院1內分泌科，4心內科，5腎內科，山東濟南250033;2青島市立醫院內分泌科，山東青島266071;山東大學附屬省立醫院3兒外科，7內分泌科，山東濟南250021;6泰安市中心醫院分院職二科，山東泰安271000)

目的:觀察硫化氫(H2S)對ob/ob小鼠皮膚創面愈合的影響并探討其作用機制。方法:將ob/ob小鼠隨機分為生理鹽水組、胰島素組和NaHS(H2S供體)組，C57BL/6小鼠作為對照組，構建小鼠背部皮膚創面模型。干預后檢測各組H2S釋放量;用Western blot檢測胱硫醚γ-裂解酶(CSE)及基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表達差異;用RT-qPCR檢測CSE的mRNA表達變化;使用免疫組織化學法檢測中性粒細胞及單核/巨噬細胞的浸潤數量;使用ELISA檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-6的水平;用Masson染色檢測膠原沉積情況。結果:ob/ob小鼠皮膚創面肉芽組織中H2S釋放及CSE蛋白、mRNA的表達水平以及膠原沉積顯著低于C57BL/6小鼠(P＜0.05)。外源性H2S可加速ob/ob小鼠皮膚創面愈合(P＜0.05)，增加膠原沉積。ob/ob小鼠創面中性粒細胞及單核/巨噬細胞浸潤數量，TNF-α、IL-6的水平及MMP-9蛋白表達水平顯著增加(P＜0.05)，NaHS組顯著降低。結論:H2S可顯著改善糖尿病難愈性潰瘍的愈合，作用機制可能與其抗炎作用有關。

糖尿病;創面愈合;硫化氫;胱硫醚γ-裂解酶;抗炎作用

糖尿病足是糖尿病常見的微血管并發癥，常引起較高的致殘率和致死率［1］。近年來研究表明，糖尿病持續炎癥狀態是糖尿病難愈性潰瘍的重要機制。有學者發現在糖尿病患者中，中性粒細胞、單核/巨噬細胞數量、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β等炎癥反應因子持續升高［2］;大量的炎性因子可刺激創面多種細胞產生過量基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，分解細胞外基質成分，從而影響成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞等修復細胞在創面的附著及肉芽組織形成，導致傷口愈合延遲。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化碳(carbon monoxide，CO)及一氧化氮(nitric oxide，NO)后發現的氣體信號分子。在哺乳動物體內，硫化氫是以L-半胱氨酸為底物，在吡哆醛磷酸鹽依賴性胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)及胱硫醚β-合酶(cystathionine β-synthase，CBS)催化下產生的［3］。CBS主要分布于神經系統中，而CSE主要分布于外周系統中，特別是血管系統中［4］。在很長的時間里，硫化氫被認為是一種有毒的氣體，最近研究發現硫化氫參與到很多生理病理過程中，尤其對炎癥反應、基質金屬蛋白酶等有重要的調節作用，最新研究發現硫化氫可以促進糖尿病小鼠的傷口愈合，其機制可能與恢復內皮祖細胞功能及激活血管緊張素-1有關［5］，但是H2S/CSE代謝通路與糖尿病難愈性潰瘍中炎癥細胞浸潤及MMPs之間有無內在聯系尚未見報道。本文擬觀察硫化氫在糖尿病傷口愈合的作用，從其對炎癥的調控方面探討其作用機制。

材料和方法

1 材料

C57BL/6及 B6.VLepob/J(leptin-deficient，ob/ ob)小鼠購于北京華阜康實驗動物技術有限公司。兔抗CSE購于Proteintech。NaHS、兔抗CD68、兔抗EPO和兔抗MMP-9購于Abcam。兔抗GAPDH、鼠抗β-actin及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔及羊抗鼠Ⅱ抗購于北京中杉金橋公司。ECL發光液、改良型BCA試劑盒、反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司。小鼠IL-6 ELISA試劑盒及小鼠TNF-α ELISA試劑盒購于聯科生物科技有限公司。

2 主要方法

2.1 創立糖尿病小鼠創面模型 尾靜脈檢測ob/ob小鼠的血糖水平，隨機血糖≥11.1 mmol/L確定為2型糖尿病模型。所有小鼠在乙醚麻醉狀態下，行背部皮膚全層皮膚切開術，創立直徑9 mm的圓形傷口。將ob/ob小鼠隨機分為3組:生理鹽水組、胰島素(6 U·kg－1·d－1)組和NaHS(50 μmol·kg－1· d－1)組［5］;C57BL/6組注射生理鹽水作為對照組。創面創立的時間設為第0天，建立后2 h開始腹腔注射藥物干預至創面完全愈合，每隔1 d給創面拍照，使用三腳架保證數碼相機距離創面的距離固定，Photoshop CS6軟件計算創面愈合速率，愈合速率為: 1－(第x天創面面積/第0天創面面積)。分別在創面創立后第3天、第6天或者第10天處死小鼠，第10天處死小鼠前尾靜脈測定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)。第3天和第6天處死小鼠后快速取創面及周圍1 cm皮膚放入液氮儲存或者放入4%多聚甲醛中固定，待用。該動物實驗研究經過山東大學醫學院動物實驗倫理審查委員會同意。

2.2 H2S濃度測定 藥物干預6 d后，取小鼠背部創面肉芽組織20 mg置于100 mmol/L冰凍磷酸鉀緩沖液中(pH 7.4)勻漿，4℃條件下離心 20 min (14 000 r/min)取上清并用BCA法測定蛋白濃度，冰上配制反應液500 μL(430 μL的組織裂解液，20 μL 10 mmol/L的L-半胱氨酸，20 μL 2 mmol/L的5-磷酸吡多醛，30 μL PBS);將離心管封口，37℃水浴孵育30 min;依次加入250 μL 1%的醋酸鋅、250 μL 10%的三氯醋酸、133 μL 20 mmol/L對苯二胺鹽酸、133 μL 30 mmol/L三氯化鐵，避光20 min后取300 μL終反應液，于670 nm測量吸光度。根據標準曲線計算H2S的含量，并使用蛋白濃度矯正結果［5］。

2.3 Western blot實驗 稱取20 mg肉芽組織于300 μL RIPA及3 μL PMSF中勻漿，冰上裂解1 h，4℃條件下離心30 min(14 000 r/min)，取上清并用BCA法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣，經10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉至PVDF膜。5%TBS封閉1 h，4℃條件下，I抗孵育過夜;TBST洗膜8 min 4次，1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記 II抗室溫孵育1 h;充分洗膜后，ECL顯色;NIH ImageJ 1.42定量分析結果。

2.4 RT-qPCR實驗 依照已發表文章［6］的操作步驟提取肉芽組織RNA，根據反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒的說明分別進行反轉錄及熒光定量聚合酶鏈式反應，18 s rRNA的上游引物為5’-CGCGGTTCTATTTTGTTGGT-3’，下游引物為5’-AGTCG-GCATCGTTTATGGTC-3’;CSE的上游引物為 5’-CCATCCACGTGGGACAAGAG-3’，下游引物為5’-GCGGCTGTATTCAAAACCCG-3’。

2.5 免疫組織化學染色法 創面組織固定后經石蠟包埋，切成5 μm的切片。經脫蠟及水化后，置于微波爐內進行抗炎修復，3%過氧化氫溶液室溫避光孵育25 min，3%BSA室溫封閉30 min，平放于濕盒內4°C加I抗孵育過夜，洗滌后加HRP標記的II抗室溫孵育50 min，洗滌后DAB顯色，Harris蘇木素復染細胞核，最后脫水封片，鏡下觀察。

2.6 Masson染色 經脫蠟及水化后的肉芽組織切片經Weigert氏鐵蘇木素染色5 min;流水沖洗后用1%的鹽酸乙醇分化數秒鐘;流水沖洗返藍;麗春紅染色5～10 min，超純水快速漂洗;磷鉬酸處理3～5 min;不用水洗，直接用苯胺藍液復染5 min;1%冰醋酸處理1 min;最后封片鏡下觀察。細胞核呈藍黑色;膠原纖維呈藍色;纖維素以及肌纖維顯示紅色。

2.7 ELISA 取肉芽組織10 mg于PBS及PMSF (1∶100)中勻漿，4℃條件下離心20 min(12 000 r/ min)，取上清并用改良型BCA法測定蛋白濃度。取上清液后根據ELISA試劑盒的說明分別測量TNF-α 和IL-6的含量，并使用蛋白濃度來矯正結果。

3 統計學處理

采用GraphPad Prism 5.0統計分析，各組測定值均以均數±標準誤(mean±SEM)表示，兩組間數據比較采用兩樣本t檢驗;不同時間和處理4組間的比較使用兩因素重復測量方差分析，各時點處的組間比較使用Bonferroni校正t檢驗;單純4組間比較采用完全隨機設計資料的方差分析，組間比較使用Bonferroni校正t檢驗;以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 在 ob/ob小鼠中，H2S釋放及 CSE的蛋白及mRNA的表達水平降低

為確定H2S/CSE代謝通路與糖尿病難愈性潰瘍發生機理的關系，我們首先比較了皮膚及肉芽組織中H2S的濃度在糖尿病小鼠及非糖尿病小鼠中的差異。如圖1所示，糖尿病小鼠的皮膚及肉芽組織中H2S的濃度均顯著下降(P＜0.05)，經過6 d的NaHS治療，肉芽組織中H2S的濃度明顯升高(P＜0.01)。同樣的，CSE的蛋白及mRNA表達水平在糖尿病小鼠中顯著下降。創面創立后第10天檢測ob/ ob小鼠空腹血糖顯示，NaHS組的血糖水平與生理鹽水組比較無統計學顯著性。

Figure 1.The levels of H2S，CSE protein and CSE mRNA in wound granulation tissue were decreased in diabetic mice.A:the skin tissue H2S levels in C57BL/6 and ob/ob mice;B:granulation tissue H2S level at day 6 after wound establishment and NaHS treatment;C: the CSE protein expression in wound granulation tissue was decreased in ob/ob mice at different time points; D:the mRNA level of CSE in the wound granulation tissue was decreased in ob/ob mice;E:the fasting blood glucose changes.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs ob/ob group.圖1 ob/ob小鼠皮膚及肉芽組織中H2S濃度及CSE的蛋白及mRNA的表達水平降低

2 H2S可促進ob/ob小鼠創面愈合

為了進一步確定H2S/CSE代謝通路表達降低與糖尿病難愈性潰瘍是否有關，我們檢測了外源性H2S對傷口愈合的影響。結果顯示ob/ob小鼠的創面愈合速度明顯低于C57BL/6小鼠，經過NaHS干預，與ob/ob小鼠加生理鹽水干預相比創面愈合速率明顯加快(P＜0.05或P＜0.01)，胰島素治療后愈合速率稍有增加，但差異無統計學顯著性，見圖2。

Figure 2.NaHS(H2S donor)accelerated wound healing in the ob/ob mice.Mean±SEM.n=4.#P＜0.05 vs C57BL/6;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs ob/ob.圖2 H2S促進ob/ob小鼠皮膚創面愈合

3 H2S可抑制創面中性粒細胞及單核/巨噬細胞的浸潤

ob/ob小鼠創面中性粒細胞及單核/巨噬細胞數量明顯多于C57BL/6小鼠(P＜0.01)，經過NaHS治療6 d后，ob/ob小鼠的中性粒細胞及單核/巨噬細胞數量顯著降低(P＜0.01)，經胰島素治療后ob/ob小鼠炎癥細胞數量的變化差異無統計學顯著性，見圖3。

Figure 3.H2S attenuated neutrophil and macrophage infiltration in the ob/ob mice.A:the images showed representative neutrophil (MPO+)and monocyte/macrophage(CD68+)infiltration that stained brown(×200);B:the quantitative analysis of neutrophil and monocyte/macrophage infiltration measured under microscope as the total number of infiltrating MPO+or CD68+cells per high power field(HPF，×400).Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs ob/ob group.圖3 H2S抑制ob/ob小鼠皮膚創面的中性粒細胞及單核/巨噬細胞的浸潤

4 H2S可降低促炎癥因子的產生

ob/ob小鼠肉芽組織中IL-6及TNF-α炎癥因子的水平明顯高于對照組小鼠(P＜0.05)，而經過NaHS干預6 d后，ob/ob小鼠中的IL-6及TNF-α水平明顯降低(P＜0.05)，而經過胰島素治療后，IL-6 及TNF-α水平的變化差異無統計學顯著性，見圖4。

5 H2S可降低MMP-9的蛋白表達

ob/ob小鼠創面肉芽組織MMP-9的蛋白表達明顯高于C57BL/6小鼠(P＜0.05)，經過NaHS治療3 d后，ob/ob小鼠MMP-9的蛋白表達顯著降低(P＜0.05)，見圖5。

6 H2S可增加膠原蛋白的沉積

ob/ob小鼠創面的膠原沉積明顯多于野生型小鼠，經過NaHS治療6 d后，ob/ob小鼠的創面膠原沉積顯著降低，經胰島素治療后ob/ob小鼠創面膠原沉積無明顯增加，見圖5。

討論

Figure 4.The effects of H2S on IL-6(A)and TNF-α(B)secretion in ob/ob mice.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs ob/ob group.圖4 H2S顯著降低TNF-α和IL-6水平

血管系統中內源性H2S主要通過半胱氨酸由CSE催化作用產生［7］，具有強大的抗氧化、抗凋亡、促進血管生成和抗炎作用［8-9］。有研究發現糖尿病小鼠血漿中H2S濃度及CSE活性顯著降低［5］。本研究發現糖尿病小鼠皮膚及肉芽組織中H2S釋放量明顯低于對照組小鼠，這與其他學者研究結果是一致的［5，10］，CSE是分布于血管系統中催化產生H2S的酶，我們研究中證實糖尿病小鼠肉芽組織中CSE蛋白及mRNA表達水平明顯低于野生型小鼠。此外，我們用以100 μmol/L的NaHS(可為H2S的供體)［5］經過6 d干預，肉芽組織中的H2S釋放量明顯升高。為了明確H2S與糖尿病難愈性潰瘍的關系，我們進一步觀察了H2S干預后糖尿病小鼠創面愈合的變化，結果顯示H2S治療顯著地促進糖尿病創面愈合速率。有學者發現給予外源性H2S對于胰島素敏感性無明顯改善作用［11］，可以促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取，同時可以直接抑制高糖刺激下的胰島素分泌［12］。我們的實驗顯示NaHS組的血糖水平與生理鹽水組比較無統計學顯著性。同時為排除血糖水平對創面愈合速率的影響，我們設置了胰島素治療組，結果顯示胰島素治療組愈合速率與對照組相比無統計學顯著性，從而提示H2S/CSE代謝通路表達降低可能是造成糖尿病難愈性潰瘍的機制之一。

Figure 5.The effects of H2S on the protein expression of MMP-9 and collagen formation in the granulation tissues.A:the protein expression of MMP-9 in the wound granulation tissues was increased in ob/ob mice;B:the effect of H2S on the protein levels of MMP-9;C:representative photomicrographs of Masson trichrome staining(×40).Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs ob/ob.圖5 H2S顯著降低MMP-9蛋白表達的水平，增加創面的膠原沉積

為進一步確定H2S促進糖尿病創面愈合的作用機制，我們觀察了H2S外源性供體(NaHS)干預后對創面炎癥細胞浸潤和炎癥因子水平的影響。結果提示H2S抑制創面中性粒細胞及單核/巨噬細胞的浸潤，并且降低TNF-α和IL-6的水平。眾所周知，糖尿病難愈性潰瘍的形成與創面慢性炎癥遷延有密切關系。正常情況下，適當的炎癥反應是創面愈合的必要條件。組織損傷后，中性粒細胞、單核/巨噬細胞向創傷部位遷移，通過去除壞死組織為傷口愈合提供床面，為下一步修復創造條件［13］，同時這些細胞還分泌各種細胞因子及生長因子，吸引周圍成纖維細胞及血管內皮細胞向創面遷移，通過產生細胞外基質及血管再生形成肉芽組織。正常情況下，創面急性炎癥反應是自限性的，而糖尿病狀態下創面炎癥反應失控，主要表現為修復期炎癥細胞的持續浸潤以及TNF-α、IL-6等炎癥因子水平持續升高［14］。因此，硫化氫對促進糖尿病創面愈合的作用機制可能是通過其抗炎作用實現的，但詳細機制尚有待進一步探討。

MMPs是由巨噬細胞分泌的蛋白酶超家族，可以降解多種細胞外基質成分(extracellular matrix，ECM)。而ECM可以為創面愈合提供床面，幫助內皮細胞、纖維母細胞、角質細胞遷移附著以及膠原沉積。Vacek等［15］發現過表達CSE和CBS、增加內源性H2S可顯著性增加MMPs水平，同時降低特異性抑制因子金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMPs)的水平。H2S可以降低MMP-9的表達同時誘導MMP-2的表達，我們實驗發現在糖尿病小鼠肉芽組織MMP-9的表達水平升高，膠原沉積減少，而MMP-9水平的升高是糖尿病難愈性潰瘍的機制之一，經H2S治療后，可以降低ob/ob小鼠肉芽組織MMP-9的表達水平并且增加了創面的膠原沉積。所以，我們有理由相信H2S通過抑制MMP-9的表達來促進傷口愈合。

總之，本研究結果提示H2S/CSE代謝通路表達降低可能是糖尿病難愈性潰瘍形成的重要機制之一。而外源性H2S可以促進糖尿病創面愈合，其機制可能與抑制中性粒細胞、單核/巨噬細胞炎癥細胞浸潤，降低炎癥因子及MMP-9的表達水平有關。本研究為糖尿病難愈性潰瘍的防治提供了新的思路，研究結果有待體內實驗進一步證實。

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(責任編輯:陳妙玲，羅 森)

Effects of hydrogen sulfide on impaired wound healing in ob/ob mice

ZHAO Hui-chen1，2，CHAI Jia-chao3，ZHENG Jie4，WANG Yuan-mei1，WANG Yuanyuan5，GUO Xiu-zhi6，GUAN Qing-bo7，LIU Yuan-tao2

(1Department of Endocrinology，4Department of Cardiology，5Department of Nephrology，The Second Hospital of Shandong University，Jinan 250033，China;2Department of Endocrinology，Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266071，China;3Department of Pediatric Orthopaedic，7Department of Endocrinology，Provincial Hospital Affiliated to Shandong University，Jinan 250021，China;6The Second Department of Occupational Medicine，Central Hospital Branch of Taian City，Taian 271000，China.E-mail:sduliuyuantao@163.com;guanqingbo@medmail.com.cn)

AIM:To investigate the role of hydrogen sulfide(H2S)on impaired wound healing in ob/ob mice and the underlying mechanism.METHODS:The ob/ob mice were randomly divided into 3 groups，including vehicle，insulin and NaHS for treatment.C57BL/6 mice were treated with vehicle as control.Full-thickness punch biopsy wounds were created on the mice.Firstly，H2S concentrations in the skins and granulation tissues were measured.The mRNA expression of cystathionine γ-lyase(CSE)was detected by RT-qPCR.The protein expression of CSE and MMP-9 were determined by Western blot.The neutrophil and monocyte/macrophage infiltration was analyzed by immunohistochemistry method.The levels of tumor necrosis factor(TNF)-α and interleukin(IL)-6 were measured by ELISA.Collagen formation was measured by Masson staining.RESULTS:The H2S levels in the skin and granulation were significantly decreased in ob/ob mice and increased in the NaHS-treated mice(P＜0.05).CSE expression at mRNA and protein levels was significantly decreased in ob/ob mice compared with the control mice(P＜0.05).The wound healing period was significantly shorter in NaHS group than that in vehicle-treated ob/ob mice group(P＜0.05)，in which the insulin group had no difference with vehicle ob/ob mice group.The neutrophil and monocyte/macrophage infiltration，and TNF-α and IL-6 levels were significantly increased in ob/ob groups，but were decreased in NaHS group(P＜0.01 or P＜0.05).Meanwhile，NaHS increased collagen formation in the granulation tissues of ob/ob mice.CONCLUSION:H2S/CSE down-regulation contributesto impaired wound healing in diabetes，which is alleviated by exogenous H2S possibly through anti-inflammation.

Diabetes;Wound healing;Hydrogen sulfide;Cystathionine γ-lyase;Anti-inflammation

R587.2;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.003

1000-4718(2016)07-1167-07

2016-02-24

2016-05-16

山東省自然科學基金資助項目(No.ZR2012HL50)

△劉元濤Tel:0532-88905638;E-mail:sduliuyuantao@163.com;管慶波Tel:0531-85186910;E-mail:guanqingbo@ medmail.com.cn