原花青素單一活性成分B2對高糖作用下人內皮祖細胞的保護作用

王麗萍， 李 莉， 姚計文， 李 博

［1北京師范大學社區衛生服務中心(醫院)，北京100875;2北京市公安醫院內科，北京100121;3北京市和平里醫院心血管內科，北京100013］

原花青素單一活性成分B2對高糖作用下人內皮祖細胞的保護作用

王麗萍1△， 李 莉2， 姚計文3， 李 博3

［1北京師范大學社區衛生服務中心
(醫院)，北京100875;2北京市公安醫院內科，北京100121;3北京市和平里醫院心血管內科，北京100013］

目的:研究原花青素單一活性成分B2(PC-B2)對高糖環境下人內皮祖細胞(EPCs)的保護作用及其作用機制。方法:從健康人外周血中分離誘導培養人EPCs，并進行鑒定。將EPCs分為control組(PBS處理)、高滲對照組(25 mmol/L甘露醇處理)、高濃度30 mmol/L葡萄糖作用組以及不同濃度(2、10和50 mg/L)PC-B2與30 mmol/L葡萄糖共處理組。使用CCK-8法檢測各組中EPCs活力的變化;同時檢測各組EPCs中乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和還原型谷胱甘肽(GSH)水平;ELISA方法檢測各組EPCs上清中一氧化氮(NO)、內皮素-1(ET-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)的含量變化;流式細胞術檢測各組中EPCs活性氧簇(ROS)生成和凋亡率變化;Western blot檢測血管內皮生長因子(VEGF)和血管內皮生長因子受體-2(VEGFR-2)的表達情況。結果:與control組相比，高糖作用組中人EPCs的活力顯著下降(P ＜0.05);LDH漏出量以及MDA、ET-1、ICAM-1和VCAM-1含量均顯著升高(P＜0.05);而SOD和GSH活性以及NO含量顯著降低(P＜0.05);細胞中ROS含量和凋亡率顯著上升(P＜0.05);EPCs中VEGF和VEGFR-2表達量顯著降低(P＜0.05)。與高糖作用組相比，不同濃度PC-B2作用組EPCs活力均明顯回升(P＜0.05);LDH漏出量以及MDA、ET-1、ICAM-1和VCAM-1含量均逐漸下降(P＜0.05);SOD和GSH活性以及NO含量均顯著上升(P＜0.05);細胞中ROS生成和凋亡率逐漸下降(P＜0.05);而EPCs中VEGF和VEGFR-2表達量也隨之逐漸上升，并具有濃度依賴性(P＜0.05)。結論:PC-B2能夠提升高糖作用下人EPCs活力，減少高糖引起的氧化損傷，恢復EPCs正常功能，降低高糖誘導的炎癥因子和細胞凋亡，從而對人EPCs發揮保護作用，并可通過誘導VEGFR-2和VEGF表達發揮作用。

人內皮祖細胞;高糖;原花青素B2;氧化應激;細胞凋亡;血管內皮生長因子

近年研究表明，80%的糖尿病患者都會出現全身小血管或血管病變，產生血管損傷并發癥，同時糖尿病患者心血管并發癥是導致其死亡和致殘的主要原因［1］。糖尿病患者容易產生血管并發癥，主要是由于其血管內高血糖水平使血管內皮結構產生改變，生理功能喪失導致血管損傷［2］。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內皮細胞的前體細胞，能夠從骨髓動員到外周血對損傷血管進行修復。研究表明糖尿病能夠導致外周血EPCs數量的減少及功能障礙，其血管并發癥的發生發展與EPCs功能受損密切相關，但如何保護高糖環境中EPCs的研究尚少見［3］。原花青素(proanthocyanidins，PC)是一類廣泛存在于植物中的黃烷醇單體及其聚合物的天然多酚化合物，是花青素類物質的聚合物［4］。PC廣泛存在于葡萄籽、銀杏、大黃、松樹和柏樹等天然植物的根莖葉果實中，因其具有水溶性，易于被機體吸收，而比番茄紅素、蝦青素等其它脂溶性強抗氧化劑受到更廣泛和有效的關注［5］。而原花青素B2(PC-B2)是PC中主要的活性成分，目前關注較少且其作為單一成分發揮作用及機制尚未見［6］。因此本研究利用高糖作用于人EPCs，觀察單一成分PC-B2對高糖作用下人EPCs的影響，并從抗氧化應激和細胞凋亡等方面揭示其能否對EPCs發揮保護作用。

材料和方法

1 試劑和材料

M199細胞培養基和0.25%EDTA胰酶購自HyClone;胎牛血清、谷氨酰胺、谷丙酸鈉和Endogro細胞因子購自Gibco;原花青素單體活性成分B2(純度99.9%)、人淋巴細胞分離液、D-Hanks溶液和雙氫羅丹明123購自Sigma;葡萄糖和20%甘露醇購自西南藥業公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)測定試劑盒購自南京建成生物技術研究所;內皮素-1(endothelin，ET-1)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管細胞黏附分子-1 (vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)的ELISA檢測試劑盒購自武漢華美生物公司;CCK-8檢測試劑盒和Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京鼎國生物技術公司;FITC標記的單克隆鼠抗人CD133、CD34、CD31和FIK-1抗體購自BD;多克隆兔抗人血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管內皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2)和 βactin I抗購自Abcam;HRP標記的山羊抗兔IgG的II抗和ECL化學發光試劑盒購自北京中杉金橋公司。

2 主要方法

2.1 人EPCs的分離培養鑒定 取健康人捐獻外周，血用等體積人淋巴細胞分離液混勻后置于50 mL離心管中，密度梯度離心20 min，分離得到中間層人外周血單核細胞層。用D-Hanks溶液洗滌2次后，棄去上清，用含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和谷丙酸鈉、0.1%Endogro細胞因子的M199完全培養基重懸細胞，接種于膠原預先包被的細胞培養板中，37℃、5%CO2培養箱中進行培養。培養至24 h時，更換細胞培養基去掉未貼壁細胞。后每3 d更換培養基，貼壁細胞繼續培養，在倒置顯微鏡下觀察人EPCs的生長狀態。將連續培養14 d的EPCs細胞接種于6孔板中，繼續培養24 h后去除上清培養基，PBS洗滌 2遍后，先加入 100 μL的 DiI-Ac-LDL (1∶100)稀釋液，37℃孵育4 h后，PBS洗滌3次后次用4%多聚甲醛固定30 min，后加入100 μL的FITC-UEA-1(1∶500)在37℃孵育2 h。用PBS洗滌細胞后在熒光顯微鏡下觀察為UEA和LDL雙染色陽性細胞即為正在分化的人EPCs。同時收集誘導培養的EPCs稀釋濃度為1×109/L，分別避光孵育FITC標記的單克隆鼠抗人CD133、CD34、CD31和FIK-1抗體30 min后，PBS洗滌1次，進行流式細胞術檢測細胞中CD133、CD34、CD31和FIK-1陽性表達率以鑒定人EPCs。

2.2 CCK-8方法檢測EPCs的活力 將分離誘導培養至14 d的人EPCs經含0.25%EDTA的胰酶消化后，調整細胞濃度為2×108/L，接種于96孔細胞培養板中，培養6 h細胞貼壁后更換不同培養基，細胞分組為:加入與溶劑等量PBS的EPCs完全培養基為對照組(control組);加入含25 mmol/L甘露醇的EPCs完全培養基作為高滲對照組(hypertonic組);加入含高濃度30 mmol/L葡萄糖的EPCs完全培養基單獨培養組(高糖組);同時加入含不同濃度(2、10 和50 mg/L)PC-B2和30 mmol/L葡萄糖的EPCs完全培養基共培養組。在分別繼續培養24和48 h后，分別在每孔中加入10 μL的CCk-8溶液，繼續在細胞培養箱中培養2 h后用酶標儀檢測每組細胞在450 nm波長時的吸光度(A)值。

2.3 細胞中LDH、MDA、SOD和GSH的檢測 將誘導培養至14 d的人EPCs以5×108/L按照上述同樣分組種植于6孔板中，經不同培養基繼續培養48 h。收集各組EPCs培養后上清液，按照試劑盒說明利用比色法測定各組經不同處理后EPCs中LDH的漏出量，同時收集各組細胞，利用強RIPA細胞裂解液提取各組EPCs中總蛋白，按照試劑盒說明測定EPCs 中MDA含量以及SOD和GSH活性變化。

2.4 ELISA方法檢測細胞培養上清液中NO、ET-1、ICAM-1和VCAM-1的含量 收集各組EPCs細胞經不同培養基誘導處理48 h后的上清液，在－20℃凍存備用。利用酶聯免疫標記法(ELISA)試劑盒說明書分別檢測各組EPCs分泌的功能相關因子NO、ET-1和炎癥相關因子ICAM-1、VCAM-1含量。

2.5 流式細胞術檢測活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成和細胞凋亡 在各組EPCs經不同處理48 h后，用0.25%的EDTA胰酶消化離心并收集細胞，并用PBS重懸濃度為1×109/L，每組取出250 μL的懸液，先用1 μmol/L的雙氫羅丹明123避光孵育30 min，PBS洗滌1次后用150 μL PBS重懸細胞，各組細胞中活性氧自由基能夠將雙氫羅丹明123氧化成羅丹明123發出熒光，利用流式細胞術檢測各組細胞中ROS含量。另外，用FITC標記的Annexin V和PI各5 μL與EPCs混勻后在室溫下避光孵育20 min，后用PBS洗滌1次，離心收集細胞并用150 μL PBS重懸，立即用流式細胞儀檢測各組EPCs經不同處理后的凋亡情況。

2.6 Western blot檢測EPCs中VEGFR-2和VEGF的表達 收集各組經處理并培養結束的EPCs，用PBS洗滌1次后，利用強RIPA細胞裂解液提取各組EPCs中總蛋白，BCA試劑盒測定各組細胞中總蛋白濃度。每組中取出30 μg總蛋白進行12%SDSPAGE，電泳1.5 h后進行半干法轉膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉30 min后分別孵育多克隆兔抗人VEGFR-2、VEGF和β-actin(均按照1∶1 000稀釋)于4℃下孵育過夜。后用TBST洗滌3次后，用辣根過氧化物酶HRP標記的山羊抗兔IgG II抗(1∶5 000)在室溫下孵育2 h后，TBST洗滌3次后，加入ECL化學發光試劑顯影，用凝膠掃描系統顯影曝光并拍照，并用Quantity One軟件分析各組細胞中目的蛋白相對表達量。

3 統計學處理

所有數據利用SPSS 13.0軟件進行統計分析，結果用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，用SNK-q進行均數之間的兩兩比較，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

結果

1 人EPCs的培養鑒定結果

從健康人外周血中分離誘導的EPCs，在培養14 d時生長狀態良好，細胞變大變圓，呈“鋪路石子”狀，見圖1。對貼壁生長的EPCs進行DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1熒光標記，以對EPCs進行鑒定，在熒光顯微鏡下觀察發現綠色熒光標記細胞為FITC-UEA-1陽性的人EPCs細胞;紅色熒光標記細胞為經DiI-ac-LDL處理的人EPCs;而呈黃色細胞為雙熒光陽性細胞，即為正在分化的人EPCs。同時利用流式細胞術對誘導培養的人EPCs細胞特異性標記指標進行檢測，發現其中 14 d時細胞的 CD133陽性率達86.6%，CD34陽性率達 86.8%，FIK-1陽性率達93.2%，CD31陽性率僅14.7%，而培養21 d時細胞中CD31陽性率上升為80.9%，說明從健康人外周血中可分離誘導培養人EPCs并得以鑒定。

Figure 1.Culture and identification of human EPCs.A:human EPCs cultured for 14 d;B:FITC-UEA-1 positive cells;C:DiI-ac-LDL positive cells;D:double positive cells;E:the EPCs positive rate marked by CD133 at 14 d;F:the EPCs positive rate marked by CD34 at 14 d;G:the EPCs positive rate marked by FIK-1 at 14 d;H:the EPCs positive rate marked by CD31 at 14 d;I:the EPCs positive rate marked by CD31 at 21 d.圖1 人EPCs的細胞培養和鑒定

2 PC-B2對高糖作用下人EPCs活力的影響

通過CCK-8實驗檢測發現，在單獨高糖作用下人EPCs的細胞活力明顯受抑制，而經不同濃度PCB2同時處理培養能夠顯著提高人EPCs的細胞活力。由圖2可見，與control組相比，hypertonic組中人EPCs培養24 h和48 h的A值無明顯變化，而高糖作用組中人EPCs的A值均顯著下降(P＜0.05);而與高糖作用組相比，在24 h時各濃度PC-B2組中，除2 mg/L組EPCs的A值上升不明顯，10和50 mg/ L組中EPCs的A值均顯著上升(P＜0.05);在48 h時，各濃度PC-B2作用組中EPCs的A值均顯著上升(P＜0.05)。因此，選擇PC-B2作用于人EPCs 48 h進行研究。

Figure 2.The effect of PC-B2 on the viability of human EPCs treated with high glucose detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs high glucose group.圖2 CCK-8方法檢測PC-B2對高糖作用下人EPCs活力的影響

3 PC-B2對高糖作用下人EPCs中LDH、MDA、SOD和GSH水平的影響

PC-B2能夠降低高糖作用下人EPCs中LDH漏出量和MDA含量，并提升SOD和GSH活性，結果見表1。與control組相比，hypertonic組中人EPCs細胞中LDH、MDA、SOD和GSH均無明顯變化，單獨高糖作用下人EPCs細胞中LDH漏出量和MDA含量均顯著增加(P＜0.05)，而SOD和GSH活性則顯著下降(P＜0.05);在不同濃度的PC-B2同時作用時，與高糖組相比，各PC-B2組EPCs的LDH漏出量和MDA含量均逐漸下降(P＜0.05);2 mg/L組EPCs 中SOD和GSH活性有所上升，但不顯著，而10和50 mg/L組EPCs中SOD和GSH活性則顯著回升，趨于正常水平(P＜0.05)。

表1 PC-B2對高糖作用下人EPCs中LDH、MDA、SOD和GSH水平的影響Table 1.The effect of PC-B2 on the levels of LDH，MDA，SOD and GSH in the human EPCs treated with high glucose(Mean±SD.

4 PC-B2對高糖作用下人EPCs培養上清中NO、ET-1、ICAM-1和VCAM-1含量的影響

檢測發現，PC-B2能夠顯著增加高糖作用下人EPCs培養上清中的NO含量，而減少ET-1、ICAM-1 和VCAM-1的含量，如表2所示。與control組相比，hypertonic組中人 EPCs培養上清中的 NO、ET-1、ICAM-1和VCAM-1含量均無明顯變化，但單獨高糖作用組EPCs培養上清中NO含量顯著下降(P＜0.05);而ET-1和炎性因子ICAM-1、VCAM-1的含量則顯著上升(P＜0.05)。與高糖組相比，不同濃度PC-B2作用組EPCs培養上清中的NO含量逐漸回升(P＜0.05);而ET-1、ICAM-1和VCAM-1的含量則逐漸下降(P＜0.05)。

表2 PC-B2對高糖作用下人EPCs培養上清中NO、ET-1、ICAM-1和VCAM-1含量的影響Table 2.The effect of PC-B2 on the production of NO，ET-1，ICAM-1 and VCAM-1 in the culture supernatant of human EPCs treated with high glucose(Mean±SD.n=9)

5 PC-B2對高糖作用下人EPCs中ROS含量的影響

通過流式細胞術檢測發現，單獨高糖作用顯著誘導人EPCs中ROS的產生，而PC-B2能夠逐漸減少高糖誘導下人EPCs中ROS含量，見圖3。與control組相比，hypertonic組中人EPCs的ROS含量無明顯變化，但高糖單獨作用組EPCs中ROS陽性率顯著上升(P＜0.05);而與高糖組相比，不同濃度PCB2同時作用組EPCs中ROS陽性率逐漸下降，并具有濃度效應(P＜0.05)。

6 PC-B2對高糖作用下人EPCs凋亡的影響

通過流式細胞術檢測發現，單獨高糖作用顯著誘導人EPCs凋亡，而PC-B2能夠顯著減少高糖作用下人EPCs凋亡，見圖4。與control組相比，hypertonic組人EPCs凋亡率無明顯變化，高糖單獨作用組EPCs凋亡率顯著上升(P＜0.05);而與高糖組相比，不同濃度PC-B2同時作用組EPCs凋亡率逐漸下降，并具有濃度效應(P＜0.05)。

7 PC-B2對高糖作用下人EPCs中VEGFR-2和VEGF表達的影響

通過Western blot檢測發現，在高糖作用下人EPCs中VEGFR-2和VEGF表達均顯著下降;而PCB2作用能夠提升各組人EPCs中VEGFR-2和VEGF的表達，見圖5。與control組相比，高糖單獨作用組EPCs中VEGFR-2和VEGF表達均顯著降低(P＜0.05);而與高糖組相比，各不同濃度PC-B2同時作用組中VEGFR-2和VEGF表達均逐漸回升，并具有濃度依賴性(P＜0.05)。

Figure 3.The effect of PC-B2 on ROS production in human EPCs treated with high glucose detected by flow cytometry.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs high glucose group.圖3 流式細胞術檢測PC-B2對高糖作用下人EPCs中ROS生成的影響

討論

原花青素是目前國際公認的一種新型天然高效抗氧化劑，其自然資源豐富，來源廣泛，安全高效且無毒副作用，大量研究表明其具有很強的抗氧化和清除氧自由基能力，在防治癌癥、心血管疾病、抗輻射、調節免疫等各方面均具有顯著功效［7］。而單一活性成分B2是原花青素的主要成分，由2個單體(兒茶素或表兒茶素)鍵合而成，在原花青素的8種異構體中PC-B2具有最強的活性［8］。目前的研究主要集中在原花青素的作用機制中，但關于其作用是否主要通過活性最強的成分PC-B2發揮尚未知。糖尿病作為嚴重危害人類健康的疾病之一，呈逐漸上升趨勢，由于其患者血管中血糖水平高，容易誘發各種心血管并發癥［9］。EPCs作為血管內皮細胞的前體細胞，能夠被CD34、CD133和FIK-1特異性標記，而分化成內皮細胞后被CD31標記，其細胞功能的發揮對血管損傷修復和新生具有重要意義，同時與動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病治療和預后均相關［10］。而有研究表明高糖能夠抑制內皮祖細胞的增殖、遷移，進而影響血管的損傷修復，推測糖尿病患者容易發生血管病變，也可能與EPCs受損相關［11］。因此，本研究利用高糖作用于人EPCs以模擬糖尿病人血管中動員的內皮祖細胞所處環境狀態，以揭示高糖對人EPCs的損傷作用及PC-B2能否對高糖下人EPCs發揮保護作用。同時本研究中設置甘露醇高滲對照組，發現高滲因素對人EPCs細胞各項指標無明顯影響，說明人EPCs細胞功能的變化主要由高糖因素引起，而與滲透壓的改變無關。通過CCK-8檢測發現，高糖能夠顯著降低人EPCs細胞活力，而PC-B2能夠逐漸提升高糖作用下EPCs的細胞活力，并具有濃度和時間效應，表明PC-B2能夠降低高糖對人EPCs的損傷作用。

Figure 4.The effect of PC-B2 on the apoptosis of human EPCs treated with high glucose detected by flow cytometry.Mean±SD.n= 9.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs high glucose group.圖4 流式細胞術檢測PC-B2對高糖作用下人EPCs凋亡的影響

糖尿病患者心血管并發癥發生的病理原因，與其血管內高糖環境下細胞極易受到氧化應激損傷密不可分［12］。LDH在細胞糖代謝中起重要作用。其漏出量多少直接反映細胞膜完整性和細胞受損傷程度，而MDA作為脂質過氧化的產物，常作為檢測機體抗氧化功能的代表指標之一［13］。SOD和GSH都是機體內重要活性氧自由基清除劑和抗氧化劑，可通過其活力高低反映機體抗氧化、清除氧自由基的能力［14］。本研究中高糖作用組中EPCs細胞LDH漏出量和MDA含量顯著上升，而SOD和GSH活性顯著下降，說明高糖環境能夠誘導人EPCs的細胞膜損傷和氧化損傷，而使細胞發生病理變化并降低其抗氧化能力。而當PC-B2同時作用于人EPCs時，細胞中LDH漏出量和MDA含量逐漸下降，SOD和GSH活性逐漸回升，趨于正常水平，說明PC-B2能夠減少人EPCs細胞抗氧化系統受高糖損傷，維持細胞完整性和抗氧化能力。NO作為血管內皮細胞釋放的重要舒血管因子，可反映EPCs分化內皮細胞的功能強弱;ET-1是機體內強收縮血管物質，在血管損傷時顯著上升［15］。研究表明糖尿病患者血管細胞 ET-1、NO分泌的失調，促進糖尿病血管并發癥的發生，成為動脈粥樣硬化的重要因素［16］。另有研究表明高糖對動脈血管的損傷機制中，炎癥相關因子ICAM-1和VCAM-1炎癥扮演著重要作用，高糖能夠通過誘導炎癥反應損傷血管內皮細胞［17］。本研究中高糖組EPCs細胞的NO生成顯著下降而ET-1、ICAM-1和VCAM-1分泌量顯著上升，說明高糖能夠使人EPCs細胞正常分泌功能失調并誘發炎癥反應，從而加速血管損傷和動脈粥樣硬化的產生。PC-B2與高糖同時作用于人EPCs時，NO含量逐漸上升而 ET-1、ICAM-1和VCAM-1的分泌含量逐漸下降，表明PCB2能夠調節高糖作用下人EPCs中NO和ET-1的分泌功能，并降低炎癥反應以維持高糖作用下EPCs的正常生理功能。

Figure 5.The effect of PC-B2 on the expression of VEGFR-2 and VEGF in human EPCs treated with high glucose detected by Western blot.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs high glucose group.圖5 Western blot檢測PC-B2對高糖作用下人EPCs中VEGFR-2和VEGF表達的影響

研究表明，血管內高糖水平誘導內皮細胞氧化應激反應增加，使細胞結構和功能受損，并最終導致細胞凋亡［18］。糖尿病患者心血管并發癥和動脈粥樣硬化發生率顯著高于正常人也是因為其血管內細胞在高糖環境中容易發生凋亡［19］。本研究中也發現高糖作用下人EPCs細胞的凋亡率顯著上升，直接驗證高糖環境對人EPCs的損傷作用;而不同濃度PC-B2同時作用組中EPCs的凋亡率則顯著下降，說明PCB2在高糖環境中能夠發揮保護人 EPCs的作用。VEGF是一種能夠促進血管生成的血管內皮細胞因子，常作為EPCs細胞培養的誘導因子。Guo等［20］研究已表明VEGF能夠直接促進EPCs細胞增殖、遷移并促進EPCs細胞發揮修復損傷血管的功能。而VEGFR-2是血管內皮生長因子的受體之一，主要在生理或病理損傷時與VEGF結合發揮作用，研究表明EPCs細胞中表達的VEGFR-2被激活后，能夠調控細胞增殖，并維持細胞正常生理功能［21］。本研究中高糖作用組人EPCs細胞中VEGF和VEGFR-2相對表達量顯著下降，說明高糖可能通過降低VEGF 和VEGFR-2的表達而對血管中EPCs造成損傷。當不同濃度PC-B2與高糖同時作用于人EPCs時，細胞中VEGF和VEGFR-2表達量能夠逐漸上升，顯著高于高糖組，說明PC-B2能夠通過誘導VEGF和VEG-FR-2的表達，從而對人EPCs細胞發揮保護作用。

綜上所述，本研究首次發現單一活性成分PC-B2能夠提升高糖作用下人EPCs細胞增殖活力，降低高糖引起的氧化損傷，恢復EPCs正常分泌功能，降低高糖誘導的炎癥因子的分泌和細胞凋亡，從而對人EPCs發揮保護作用，并可通過誘導 VEGFR-2和VEGF表達發揮作用。通過本研究對于臨床利用天然抗氧化劑PC-B2防治高血糖引起的心血管并發癥具有重要意義，可為糖尿病性血管損傷修復、動脈粥樣硬化治療等提供新的思路和理論依據。

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(責任編輯:盧 萍，羅 森)

Protective effect of procyanidin single active ingredient B2 on human endothelial progenitor cells under high glucose stimulation

WANG Li-ping1，LI Li2，YAO Ji-wen3，LI Bo3

［1Beijing Normal University Community Health Service Center
(Hospital)，Beijing 100875，China;2Department of Internal Medicine，Beijing Police Hospital，Beijing 100121，China;3Department of Cardiology，Beijing Hepingli Hospital，Beijing 100013，China.E-mail:keyanxiangmu1@163.com］

AIM:To study the protective effect of procyanidin single active ingredient B2(PC-B2)on human endothelial progenitor cells(EPCs)stimulated with high glucose.METHODS:The human EPCs were isolated from peripheral blood of healthy people and identified.The EPCs were divided into control group(PBS treatment)，hypertonic control group(25 mmol/L mannitol treatment)，high glucose(30 mmol/L)group，and different concentrations(2，10 and 50 mg/L)of PC-B2+30 mmol/L glucose groups.The viability of EPCs was detected by CCK-8 assay.The levels of LDH，MDA，SOD and GSH in the EPCs were detected.The changes of NO，ET-1，ICAM-1 and VCAM-1 in the EPCs cultured medium were measured by ELISA.The cell apoptotic rate and reactive oxygen species(ROS)in the EPCs were analyzed by flow cytometry.The expression of VEGF and VEGFR-2 in the EPCs were determined by Western blot.RESULTS:Compared with control group，the viability of human EPCs was decreased significantly in 30 mmol/L glucose group(P＜0.05).The LDH leakage，MDA content and the releases of ET-1，ICAM-1 and VCAM-1 were induced signifi-cantly(P＜0.05)，but SOD and GSH activity and NO production were decreased significantly(P＜0.05).The ROS and cell apoptotic rate were increased significantly(P＜0.05).The expression of VEGF and VEGFR-2 in the EPCs were decreased(P＜0.05).When human EPCs were treated with different concentrations of PC-B2 and 30 mmol/L glucose，the viability was obviously rebounded(P＜0.05)，the LDH leakage，MDA content and the releases of ET-1，ICAM-1 and VCAM-1 were decreased gradually(P＜0.05)，the SOD，GSH activity and NO production were increased significantly (P＜0.05)，the ROS and cell apoptotic rate were decreased significantly(P＜0.05)，and the expression of VEGF and VEGFR-2 in the EPCs was increased gradually(P＜0.05).CONCLUSION:PC-B2 enhances the viability of human EPCs under high glucose condition，reduces high glucose-induced oxidative damage，restores the EPCs normal function，and reduces the releases of inflammatory cytokines and apoptosis，thus playing a protective effect on human EPCs through inducing the expression of VEGF and VEGFR-2.

Human endothelial progenitor cells;High glucose;Procyanidin B2;Oxidative stress;Apoptosis; Vascular endothelial growth factor

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.005

1000-4718(2016)07-1180-09

2015-12-08

2016-01-21

△Tel:010-58805431;E-mail:keyanxiangmu1@163.com